ТИПИФИКАЦИЯ НА ВИРУСА НА ЧОВЕШКИ ПАПИЛОМА HPV И НЕЙНИТЕ ВРЪЗКИ С ХАРАКТЕРИСТИКИ НА НАСЕЛЕНИЕТО И ТРАВМИ ПРИ РАК НА МАТКАТА ВРАТА ПРИ ЖЕНИТЕ ОТ ОБЩИНАТА ПАСТО СИНДИ НАТАЛИ НИКОЛА БАНОВА ДЕНСАВИНДАНСКИ ДЕНСАВАРСКИ ДЕНСАВЕР
ТИПИФИКАЦИЯ НА ВИРУСА НА ЧОВЕШКИ ПАПИЛОМА HPV И НЕЙНИТЕ ВРЪЗКИ С ХАРАКТЕРИСТИКИ НА НАСЕЛЕНИЕТО И ТРАВМИ ПРИ РАК НА МАТКАТА ВРАТА НА ЖЕНИТЕ ОТ ОБЩИНА ПАСТО СИНДИ НАТАЛИ НИКОЛА БЕНВАЙДЪР ГЛАВА БЕНВАЙДЪР ГЛАВА БЕНВАДРИ ГЕНЕРА БЕНВАЙДЪР ВЪЗДЕЙСТВИЕ ЗА ГЛАВЕН ВИДЕН В ГЕНЕРА БИНВЕР В ГЕНЕРА БИВЕН ВИДЕЙ Магистър Науки Микробиология УНИВЕРСИТЕТ НА НАРИНО ФАКУЛТЕТ ПО ТОЧНИ И ПРИРОДНИ НАУКИ КАФЕДРА ПО БИОЛОГИЯ САН ДЖУАН ДЕ ПАСТО 2014 2
Идеите и заключенията, предоставени в дипломната работа, са изключителната отговорност на автора. Член 1 № 324 от 11 октомври 1966 г., издаден от Почетния висш директивен съвет на Университета в Нариньо. 3
Бележка за приемане Милена Гереро Флорес Директор Доли Марго Ревело Ромо Хурадо Едит Мариела Бурбано Росеро Хурадо Сан Хуан де Пасто, май 2014 г. 4
На моите колеги Хуан Пабло, Ванеса, Даяна, Никсън, Карлос, Каролина, Марио, Хуан Густаво, Марсела, Кристиан за тяхната компания. Благодаря много на всички тях. 6
ПОСВЕТЕНИЕ На теб, Боже, че ми даде сили, енергия и любов да завърша това разследване. На моите родители Хосе Никола и Сесилия Бенавидес, на моите братя Рикардо, Даяна, Давид и Маурисио, които винаги ме подкрепяха и вярваха, давайки ми своята любов и разбиране. На моите колеги за цялата им помощ, думи за подкрепа, съвет и добра енергия. 7
СЪДЪРЖАНИЕ ВЪВЕДЕНИЕ. 23 1. ЦЕЛИ. 26 1.1 ОБЩА ЦЕЛ. 26 1.2 СПЕЦИФИЧНИ ЦЕЛИ. 26 2. СЪСТОЯНИЕ НА ИЗКУСТВОТО. 27 2.1 ЧОВЕШКИ ВИРУС НА ПАПИЛОМА - HPV. 27 2.1.1 Видове и класификация на HPV. 27 2.1.2 Геном и структура на HPV. 29 2.1.3 Описание на регионите на генома на HPV. 30 2.1.4 Област на късен израз L1 и L2. 31 2.1.5 Варианти на човешкия папиломен вирус. 32 2.2 HPV и рак на маточната шийка. 33 2.3 Естествена история на CCU. 36 2.4 Откриване и молекулярно типизиране на HPV. 38 2.5 Рискови фактори в CCU. 41 2.5.1 Брой сексуални партньори. 41 2.5.2 Възраст на започване на полов акт. 2.5.3 Употреба на орални контрацептиви. 42 2.5.4 Инфекция с други организми. 42 2.5.5 Пушене. 43 8
2.5.6 Брой бременности. 43 2.5 7 Конвенционална цитология. 44 3. МЕТОДОЛОГИЯ. 46 3.1 Описание на изследваната популация. 46 3.1.1 Етични съображения. 47 3.1.2 Критерии за включване. 47 3.1.3 Критерии за изключване. 47 3.1.4 Популационни променливи, разгледани в проучването. 47 3.1.5 Размер на пробата. 47 3.2 Регистрация на информация, включване на проби, транспорт и консервация. 47 3.2.1 Регистър на информацията за населението. 47 3.2.2 Еднофамилен анализ. 48 3.2.3 Включване на проби. 48 3.3 Обработка на проби за молекулярно типизиране на HPV. 48 3.4 Качествен анализ на проби чрез β-глобинова PCR. 49 Подготовка на проби за качествен анализ. 49 3.4.1 Оценка на качеството на пробата чрез PCR/HHB амплификация. 49 3.4.2 Проверка на PCR/HHB продукти чрез електрофореза в агарозен гел. 51 3.4.3 Интерпретация на резултатите от PCR/HHB. 51 3.5 Откриване и молекулярно типизиране на HPV. 51 3.5.1 Въвеждане на текст с обратна линия. 52 3.5.2 PCR-L1 GP5 +/GP6 + и ДНК секвениране. 56 9
4.3.1 Характеристики на популацията при жени с цитология (-), ASCUS и HPV инфекция. 87 4.3.1.1 Социодемографски характеристики и HPV инфекция. 87 4.3.1.1.1 Възраст и HPV инфекция. 88 4.3.1.1.2 Брой сексуални партньори и HPV инфекция. 89 4.3.1.2 Гинеко-акушерски характеристики и HPV инфекция. 91 4.3.1.2.1 Метод на планиране и HPV инфекция. 4.3.1.2.2 Други организми и HPV инфекция. 93 4.3.1.3 Реактивни клетъчни промени, свързани с възпаление и HPV инфекция. 93 4.3.2 Анализ на жени с LIEBG, LIEAG, CCU лезии и HPV инфекция. 94 4.3.2.1 Възраст на жените с LIEBG, LIEAG и CCU и HPV инфекция. 94 4.3.2.2 LIEBG, LIEAG, CCU лезии и HPV инфекция. 96 4.3.2.3 LIEBG, LIEAG, CCU лезии и типове HPV. 100 ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 102 ПРЕПОРЪКИ. 104 БИБЛИОГРАФИЯ. 105 ПРИЛОЖЕНИЯ. 127 11
Таблица 23. Честота на HPV инфекция според възрастта на жените с LIEBG, LIEAG и CCU. 95 Таблица 24. Честота на HPV инфекция при жени с LIEBG, LIEAG и CCU. 97 Таблица 25. Честота на HPV типове, открити при жени с LIEBG, LIEAG и CCU. 100 13
СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ Фигура 1. Филогенетично дърво на LCR HPV 16 последователности. 28 Фигура 2. Геном на човешкия папиломен вирус. 29 Фигура 3. Естествена история на цервикалната онкогенеза на HPV. 36 Фигура 4. Хистологично развитие на рак на маточната шийка. 38 Фигура 5. Плоскоклетъчна атипия (ASC-US). 45 Фигура 6. Карта на община Пасто, където се намират местата за включване на пробите. 46 Фигура 7. Звънене на PCO3 и PCO4 праймери в човешкия β-глобинов ген, позиция 13 nta при 123 ntg. 50 Фигура 8. Представяне на мястото на звънене на праймери GP5 + и GP6 + в генома на HPV 18, позиция 6 600 nta при 6 744 ntg. 52 Фигура 9. Амплификация на гена β-глобин в проби за измиване на маточната шийка. 73 Фигура 10. Амплификация на β-глобиновия ген в биопсични проби. 74 Фигура 11. Анализ за оптимизация на Mg ++. 77 Фигура 12. Амплификация на гена HPV L1. 77 Фигура 13. Подравняване на последователността, идентифицирана в проба UDN 217 от Blastn и MegaBlast от NCBI. 80 14
СПИСЪК НА ПРИЛОЖЕНИЯТА Приложение А. Формуляр за информирано съгласие. 127 Приложение Б. Формат на клиничната история за профилактика на рака. 132 Приложение В. Формат на резултатите от цитологията. 133 Приложение D. Тест за оптимизация на Mg ++ за PCR/L1 GP5 +/GP6 +. 133 Приложение Д. Отрицателни резултати от петна с обратна линия. 135 Приложение Е. Подравняване на последователностите на проби за четкане на маточната шийка и биопсия. 136 15
prb: Ретинобластомен протеин RCS: от съкращението на английски [Системата за бързо улавяне] mRNA: Messenger Ribonucleic Acid RLB: от съкращението на английски [Reverse Line Blot] HSV: Herpes Simplex Virus HSV-2: Herpes Simplex Virus Type 2 HIV: Вирус на човешка имунна недостатъчност HPV: Вирус на човешки папилома HPV-RA: Вирус на човешки папилома с висок риск HPV-BR: Вирус на човешки папилома с нисък риск 17
CIN II: Счита се за високостепенна сквамозна интраепителна лезия. Ограничен до базалните две трети от цервикалния епител. CIN III: При този вид нараняване, което също се счита за високостепенно, дисплазията е тежка и обхваща повече от две трети от цервикалния епител. В някои случаи, включително цялата дебелина на цервикалната лигавица. PCR-L1: Полимеразна верижна реакция, която позволява амплифицирането на фрагмент от приблизително 150 bp от гена HPV L1, използвайки праймерите GP5 +/GP6 +. ПРЕДВАРИТЕЛНОСТ: Това е броят на случаите на заболяване или събитие в популация и към даден момент. REVERSE LINE BLOT: Това е анализ, основан на обратна хибридизация, който позволява идентифицирането на 37 HPV генотипа, използвайки система за миниблотер и хибридизационна мембрана, след усилване на пробите чрез GP5 +/GP6 + PCR. HPV-RA: Човешки папиломен вирус с висок онкогенен риск, свързан с развитието на инвазивни аногенитални карциноми. BR-HPV: Човешки папиломен вирус с нисък онкогенен риск, свързан с доброкачествени лезии-брадавици и кондиломи. двайсет
което позволява да се характеризира популацията в риск от HPV инфекция и последващо развитие на CCU. CCU предполага висок поведенчески компонент на всяка засегната популация, така че е важно да се анализират някои документирани рискови фактори за други популации и да се потвърди тяхното влияние върху конкретна популация на изследването. Анализът на тези променливи и техния ефект е изключително важен за разбирането на мрежата от причинно-следствена връзка и потенциална прогресия към злокачествено заболяване. В този контекст в това изследване беше оценена молекулярна методология, базирана на адаптация на RLB, състояща се от PCRL1 + секвениране, за да се получи информация за HPV инфекция, генотипове, свързани с лезии на CCU, и взаимовръзка на някои рискови фактори като използването на орални контрацептиви, броя на сексуалните партньори, възрастта и коинфекцията с други микроорганизми, за да се разбере тяхната динамика в изследваната популация. 25
1. ЦЕЛИ 1.1 ОБЩА ЦЕЛ Да се анализира връзката между вида на HPV, социодемографските, гинеко-акушерските, клиничните характеристики и лезии на рак на маточната шийка при популация от жени в община Пасто. 1.2 СПЕЦИФИЧНИ ЦЕЛИ Да се извърши откриването и молекулярното типизиране на HPV при жени от община Пасто. Да се определи връзката между вирусния тип и някои социодемографски, гинекологично-акушерски и клинични характеристики при HPV инфекция и лезии при рак на маточната шийка. 26
Фигура 5. Плоскоклетъчна атипия (ASC-US). Клетка с ядро, нараснало два пъти и половина от нормалния си размер, но без укрепване на ядрената мембрана. Източник: Alonso et al., 2005. 45
3. МЕТОДОЛОГИЯ 3.1 Описание на изследваната популация Това проучване е проведено в продължение на две години, в което жени без цитологични аномалии, които са се съгласили да участват в изследването чрез подписване на информирано съгласие, които отговарят на критериите за включване, принадлежащи към Държавно социално предприятие Pasto Salud-ESE. За включването на тези проби от 23 IPS, принадлежащи на Pasto Salud ESE, бяха избрани произволно 8 IPS, разпределени в четири области: север, юг, изток и запад от община Pasto. Пробата за лабораторен анализ се състои от остатъка от измиване на шийката на матката (прясна проба). Изборът на популацията от жени с цитологични аномалии е извършен чрез изчерпателен преглед на всички доклади за патологията за период от 24 месеца до декември 2013 г. Включени са 32 биопсии на жени, отговарящи на критериите за включване, от de Pasto и диагностицирани с известна степен на аномалия LIEBG и LIEAG за CCU в асоциирани патолози LTDA. Фигура 6. Карта на община Пасто, където се намират местата за включване на пробите. Източник: Google Earth. 46
4.2 Резултати от откриването и молекулярното типизиране на HPV 4.2.1 Анализ на качеството на пробите чрез амплифициране на фрагмент от гена на β-глобин за цялата популация на изследването. От 160 проби за четкане на маточната шийка, 152 са положителни за гена на β-глобин и се считат за подходящи за типизиране чрез RLB и PCR-L1 GP5 +/GP6 + секвениране, резултатите от този скрининг са показани на фигура 9. Фигура 9. Амплификация на гена β-глобин в проби за измиване на маточната шийка. Ред 1: Маркер за молекулен размер на ДНК стълба на GeneRuler с ултра нисък обхват (10-300bp), Линия 2: Празна (Ултра чиста вода), Редове 3-25: PCR/HHB Усилва от пробите за маточна четка UDN183-UDN205 Източник: Това изследване. При анализа на качеството на 32-те биопсии, генът на β-глобин се амплифицира от клетъчния лизат във всички проби и те се считат за типизиране. Резултатите от този скрининг са показани на Фигура 10. 73
Фигура 11. Анализ за оптимизация на Mg ++. Линия 1: Маркер за молекулен размер на GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder (50-1000 bp), линии: 2-6: Усилва се от HPV 33 при различни количества и концентрации на Mg ++ линия 7: Празна (ултра чиста вода). Източник: Това изследване. Следователно, оптимизирането на концентрацията на MgCl2 и корекцията в реакционната смес PCR-L1 GP5 +/GP6 + позволи откриването на HPV инфекция от клетъчен лизат при 1,4% (2/143) от жените с цитология (-), в 11,1 (1/9) от жените с ASCUS и при 34,4% (11/32) от жените с LIEBG, LIEAG и CCU, за общо 14 проби HPV +. Съответните резултати са представени на фигура 12. Фигура 12. Амплификация на гена HPV L1. Линия 1: Маркер за молекулен размер HyperLadder ™ 100bp Bioline (100bp-1013bp), линия 2: Празна (ултра чиста вода), линии 3-16 PCR/L1 продукти, линии 3, 9 и 12 HPV + проби (UDN217: HPV 16, UDN 331: HPV не е определен и UDN 338: HPV 58), редове 15 и 16: Усилени положителни контроли на HPV 11 и HPV 33. Източник: Това разследване. 77
4.3 Анализ на връзката между HPV инфекция, характеристики на популацията и лезии в CCU 4.3.1 Характеристики на популацията на жени с цитология (-), ASCUS и HPV инфекция 4.3.1.1 Социодемографски характеристики и HPV инфекция. Анализът на тази популация с помощта на хи-квадрат тест, извършен между HPV инфекция и социодемографски, гинекологично-акушерски и клинични характеристики, показа, че няма статистически значима връзка, със ниво на значимост pe 4 7> 1 р-стойност 0,577 0,325 0,900 K * a, b, c, d, e: кодове на възрастовите групи. * C (-): Отрицателна цитология. # M: Брой проби; HPV +: Положителни проби за HPV инфекция. Източник: Това изследване. 87
При молекулярното откриване на HPV, индексът Kappa показва съответствие между цитологията и PCR-L1/секвениране, последното позволява откриване и типизиране на HPV-RA 16, 58 и 33, докато цитологията позволява само откриване на аномалии без идентифициране на HPV Тип. 103
ПРЕПОРЪКИ Необходимо е да се продължи валидирането на методологията, използвана в това изследване, за да се знае истинската приложимост, чувствителност, стабилност, възпроизводимост и рентабилност по отношение на други търговски налични методологии за типизиране на HPV. Препоръчително е да се проследяват тези жени с цитология (-), ASCUS (+) и HPV (+), за да се мотивират доставчиците на здравни услуги да се намесят своевременно и по този начин да се сведе до минимум появата на нови случаи на CCU. В бъдещи изследвания е препоръчително да се включат методологии, които оценяват наличието на гени като E6 и E7, тъй като те биха позволили откриване на HPV инфекция в проби с CCU и оценка на вирусно натоварване, започване на полов акт и други фактори, докладвани в генезис. на CCU. 104
Сред очакваните резултати: информацията за популацията може да се анализира заедно с молекулярна информация, за да се обясни HPV инфекцията и нейната връзка с развитието на CCU, да се характеризира популацията в риск в община Pasto за HPV инфекция и последващо развитие на CCU, прилагането на молекулярна методология за откриване на HPV и генериране на препоръки към органите, отговарящи за наблюдението и контрола за управление на пациенти с риск от развитие на CCU в Pasto * Ако решите да участвате в проучването, ще бъде взета проба за четкане на маточната шийка. За вземане на пробата ще има подходящо обучен персонал, по същия начин ще се използват стерилни материали при условията за биобезопасност, установени за този тип процедури, така че рискът да засегне здравето ви е минимален. 128
ПИСМО ЗА ОТМЯНА НА СЪГЛАСИЕ Изготвено от: Клаудия Санчес, Карън Суарес, Натали Никола и Милена Гереро Ф. POE: № 1 Page 4 Основен изследовател: Място, където ще се проведе изследването: Име на участника: Чрез този канал искам да информирам за решението си да се оттегля от това разследване по следните причини: (по избор) Подпис на участника Дата Адрес Свидетел Дата Адрес Свидетел Дата Адрес 131
Приложение Б. Формат клинична история за профилактика на рака 132
Приложение В. Формат на резултатите от цитологията 133
Приложение D. Анализ за оптимизация на Mg ++ за PCR/L1 GP5 +/GP6 + Количество реагент (µl) на реакционните компоненти E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 Свръхчиста вода 8,75 8,75 8,75 8,75 8,75 буфер (1X) 5 5 5 5 5 dntps (200 µm) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 GP5 + (1 µM) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 GP6 + (1 µM) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 HPV 33 ДНК 1 1 1 1 1 Taq pol (1,25 U) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 MgCl2 (C) (1mM) (1,5 mm) (2,0 mm) (2,5 mm) (3,0 mm) Допълнителна ултрачиста вода 3,5 µl 3 µl 2,5 µl 2 µl 1,5 µl E = MgCl2 оптимизационен тест. (C) = Концентрация 134
Приложение Д. Отрицателни резултати от петна с обратна линия. Колона 2 HPV 33 контрола, колони 3-40, проби за цервикално четкане, колона 41 HPV 33 контрола