Ефект на връзката ензим-субстрат върху ензимната хидролиза на говежди суроватка от Alcalasa® 2.4L
Ефект на връзката ензим-субстрат върху ензимната хидролиза на говежди суроватка от Alcalasa® 2.4L
Омар А. Фигероа 1
Санди П. Пенялоза 2
1 Инженерен факултет, Департамент по агроиндустриално инженерство, Универсидад де ла Гуахира, Km 5 Via Maicao, Риохача, Колумбия. (имейл: [email protected])
2 Инженерен факултет, Катедра по агроиндустриално инженерство, Универ. Популярен дел Цезар, Диагонал 21 № 29-56 Валедупар-Колумбия. (имейл: [email protected]; [email protected])
3 Факултет по фармацевтични и хранителни науки, катедра „Хранителни продукти“, Университет Антиокия, Calle 70 # 52-21, Apartado Aéro 1226, Меделин, Колумбия. (имейл: [email protected])
Целта на това проучване беше да се анализира антиоксидантният капацитет (измерен с FRAP и ABTS) и потенциалът за хелатиране на желязо във времето при различни ензимни и субстратни условия. Ензимната хидролиза на прахообразна говежди суроватка се провежда в реактор за периодична употреба с капацитет 0,5 L и постоянна температура. Хидролизатите с най-висока активност се разделят според техния молекулен размер при съотношение> 100, 10-100, + е ниско. Увеличението на степента на хидролиза благоприятства антиоксидантната активност, измерена по метода ABTS, както и хелатиращата активност на желязото на хидролизатите.
Ключови думи: ензимна хидролиза; суроватка; алкалаза; протеини; антиоксидантни пептиди
Основната цел на това проучване беше да се анализира антиоксидантният капацитет (измерен с FRAP и ABTS) и хелатиращият потенциал на желязото във времето при различни ензимни и субстратни условия. Ензимната хидролиза на говежди суроватъчен прах се провежда в реактор за периодична употреба с капацитет 0,5 L и постоянна температура. Най-активните хидролизати се разделят според техния молекулен размер при скорост> 100, 10-100, + катионите са ниски при ниски субстрати. Увеличението на степента на хидролиза благоприятства антиоксидантната активност, измерена по метода ABTS и хелатиращата активност на хидролизираните метали.
Ключови думи: ензимна хидролиза; суроватъчни протеини; алкалаза; протеини; антиоксидантни пептиди
Различни изследвания установяват връзката между биологичната активност на пептидите и тяхното молекулно тегло. По-специално, пептидните фракции с молекулно тегло между 1 - 4kDa, биха били най-интересни за хранителни и/или фармацевтични цели (Saidi et al., 2014). Както ултра, така и нанофилтрацията са технологии, използвани с относителен успех за пречистване на пептиди с биоактивни ефекти от хидролизирани млечни протеини, соя и растителни субстрати (De Castro and Sato, 2015). Реакцията на ензимна протеинова хидролиза има голяма сложност главно поради: i) разнообразния и често неизвестен характер на субстратите (първични и третични структури на различни протеини), ii) образуването на нови хидролизни субстрати с напредването на реакцията, iii) освобождаване на къси пептиди и свободни аминокиселини, причиняващи сериозни инхибиции. iv) инактивиране на ензима във времето (Valencia et al., 2015) и v) ефекти, свързани с различната реактивност на връзките по отношение на използвания ензим, както и тяхната достъпност до специфични места за реакция (третична структура и кватернер на протеини) (Fernández и Riera, 2013).
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
След това са описани елементи, свързани с управлението на реакционните системи, използваните аналитични методи и дизайна на използваните експерименти.
Система за реакция
Хидролизата се извършва в стъклен реактор с капацитет 0,5 L, с водна циркулационна риза за регулиране на температурата, свързана с циркулационна баня с термостатичен регулатор MX07R-20 (Thomas Scientific, САЩ ± 0,07 ° C). За контрол на рН и записване на температурата на реакцията е използван комбиниран стъклен електрод с неподвижна заземена мембрана, свързан към автоматичен титратор Titrando 842 (Metrohm, Швейцария), управляван от компютър (софтуер Tiamo 1.2.1), както е показано на фиг. 1. Реакционната среда непрекъснато се разбърква с помощта на магнитна бъркалка 801 (Metrohm, Швейцария) със скорост 400 rpm. Температурата и pH в системата се поддържат постоянни със стойности съответно 61 ° C и 9.
Използвана е пулверизирана суроватка от говеждо мляко, придобита от търговски доставчик в град Богота-Колумбия, с декларирано съдържание на протеин от 12%. Тези данни бяха потвърдени от метода на Kjeldahl (AOAC 2005, 954.01), като се използва 6.38 като конверсионен фактор за оценка на съдържанието на протеин. Ензимът съответства на ендопротеаза от Bacillus licheniformis от търговския препарат Alcalasa ® 2,4 L (2,4 AU-A/g) хранителен клас (Novozymes, Дания).
Фиг. 1. Схема на реакционната система на хидролиза, използвана в експеримента.
Процес на ензимна хидролиза
Реакцията беше проведена с помощта на ензимна хидролиза, контролирана с метода pH-stat, признат за най-използвания в ензимната хидролиза поради своята простота (Rutherfurd, 2010), която се състои в поддържане на рН постоянно чрез добавяне на основа или разредена киселина. За този случай, тъй като става въпрос за алкална реакция, беше използван 1 M NaOH.По принцип добавената основа за поддържане на постоянното рН неутрализира само протоните, отделени по време на разграждането на амидната връзка на протеини и пептиди при алкално рН, се заменят с катиона на основата; по този начин протоните, генерирани от хидролиза, са еквивалентни на молите на добавената основа (Adler-Nissen, 1986). Оценката на GH е направена с помощта на уравнение.
Където: h = Брой хидролизирани пептидни връзки; Htot = Общ брой пептидни връзки в протеиновия субстрат (екв/кг); VNaOH = обем на общия NaOH (L), Nb = нормалност на основата, Mp = маса на протеина (в kg), GH = степен на хидролиза.
Степента на дисоциация на α-NH2 групите, освободени в реакцията, α, се изчислява директно от уравнение (2) и зависи от работното рН и рК. Последното варира значително в зависимост от реакционната температура и може да бъде оценено съгласно уравнение (3) (Salazar et al., 2012). Използва се изчислено α от 0,992 и htot от 8,8 meq/g, което е съобщено за суроватъчните протеини (Adler-Nissen, 1986).
Където: α = степен на дисоциация на протеина и T = работна температура в градуси по Келвин.
Описание на дизайна
В анализа се проверява влиянието на E0 (150, 300 и 600 mg/L) и S0 (5.10, 10.20 и 20.40 g/L) през реакционното време (0-120 min) върху антиоксидантния капацитет in vitro (ABTS и FRAP) и хелатиращата способност на желязото (CQFe). Сравнителен анализ на еволюцията на различните зависими променливи беше извършен в две групи експерименти: A) вариращ S0 и поддържащ E0 постоянен; Б) поддържане на S0 постоянно и вариращо E0, както е посочено в таблица 1. Нивата на концентрацията на субстрата съвпадат с района, близък до стойността на Km, където началната скорост на хидролиза е значителна, в кривата на насищане. Докато използваните нива на ензими бяха определени от предишни непубликувани тестове. В анализа се използва ANOVA за повтарящи се мерки с вътрешно-субективен фактор (време: 0, 10, 20,75 и 120 минути) и между-субективен фактор (S0 или E0 за всеки експеримент), със статистически данни за ниво на значимост от 0,05. Всяка хидролиза при зададените от проекта условия се извършва в три екземпляра.
Биоактивен потенциал на хидролизата
Взети са проби в посочените часове, което представлява различна степен на хидролиза. Пробите се подлагат на 90 ° С в продължение на 10 минути за ензимно дезактивиране и след това се замразяват при -20 ° С за по-нататъшно използване при in vitro анализ на оценените антиоксидантни активности.
Таблица 1: Условия на работа (нива на контролни променливи и зависими променливи) за проведените експерименти: А) променлив субстрат и Б) променлив ензим.
Определяне на антиоксидантната активност чрез ABTS
Извършва се по метода, описан от Re et al. (1999), в който 100 μL от пробата или стандарта Trolox се смесват с 1000 μL от разтвора ABTS. След това те бяха инкубирани при стайна температура за 30 минути. Абсорбцията се записва при 730 nm в спектрофотометър Genesys ™ 10S UV-Vis UV-Vis (Thermo Scientific, САЩ), като стандартно се използва разтвор на Trolox с концентрации 0-200 µM. Резултатите са изразени като микромол еквиваленти на Trolox на грам протеин (μmol ET/g).
Определяне на антиоксидантната активност FRAP
Определя се по методологията, описана от Pulido et al. (2000), 900 µL от реактива FRAP (с TPTZ, FeCl3 и 3М ацетатен буфер), се смесват с 90 µL дестилирана вода и 30 µL проба или стандарт Trolox и се инкубират при 37 ° С в суха баня за 30 мин. Увеличението на абсорбцията при 595 nm беше измерено с помощта на спектрофотометър Genesys ™ 10S UV-Vis (Thermo Scientific, САЩ), срещу натриев ацетатен буфер. Като стандарт се използва разтвор на Trolox с концентрации 0-300 цМ. Резултатите са изразени като еквиваленти на микромол Trolox на грам протеин (μmol TE/g протеин).
Активност на хелатиране на желязо
Използван е методът, описан от Decker and Welch (1990), с някои модификации. 1 mL от пробата се смесва с 20 ul от 2mM разтвор на FeSO4 • 7H2O. Сместа се разбърква и се оставя да престои 5 минути. 40 ul от 5 тМ разтвор на феррозин бяха добавени и енергично разбъркани. Изчаква се 10 минути и абсорбцията се отчита при 562 nm. Процентът на хелатиране е изчислен съгласно уравнение 4.
Пречистване на пептидни фракции чрез ултра центрофугиране (UF)
Суроватъчните хидролизати, които показаха най-висока антиоксидантна активност, бяха концентрирани чрез ултра-центрофугиране с помощта на ултрафилтрационни епруветки Amicon Ultra-15 (Merck Millipore, Германия), с мембрани PLHK Ultracel-PL, с обем 15 ml и с граници на молекулно тегло от 100, 10 и 3 kDa. Те бяха центрофугирани при 5000 х g в продължение на 20 минути в модел U-320 центрофуга (BOECO, Хамбург, Германия). Получават се четири фракции (> 100 kDa; 10-100 kDa; Фиг. 2: Графично представяне на обратни на началната скорост при различни концентрации на субстрати (1-32 g/L) според Lineweaver-Burk.
Резултатите регистрират типично поведение за ензимна система за насищане без данни за инхибиращи ефекти от субстрата в диапазоните на оценяваната концентрация, както е показано на графиката на двойни реципрочни стойности на Lineweaver-Burk (Фиг. 2). За реакционната система LSB-Alcalasa® 2.4 L е получена стойност Vmax, равна на 0,00218 mmol/min и стойност на Km от 10,22 g/L, които са получени със значителен коефициент на определяне (R 2 = 0,968).
Ефект на ензима и субстрата върху антиоксидантния потенциал
Стойността на Km представлява мярка за афинитет между Alcalasa ® 2.4 L и субстрата, тази концентрация на субстрата е взета като референтна за анализ на ефекта на ензимната концентрация върху антиоксидантната активност (FRAP и ABTS) при различни времена на хидролиза (Exp B).
Таблица 2 показва р-стойностите за различните статистически тестове. В резултатите от многомерния анализ, четирите статистически данни: следа Pillai, Lambda на Wilks, Hotelling trace и основният корен на Рой, показват, че факторът на времето е значителен (p 20%).
Таблица 2: ANOVA на повтарящи се мерки във времето за експериментите с променлив субстрат (Exp A) и променлив ензим (Exp B), с ABTS и FRAP капацитет като отговори.
Известно е, че хидролизата с Alcase 2.4 L благоприятства антиоксидантната способност на протеините. Както е доказано в многобройни проучвания, GH се увеличава с течение на времето и по същия начин се подобрява антиоксидантният капацитет (Bah et al., 2015). Това, тъй като антиоксидантната активност се приписва главно на пептиди с нисък молекулен размер и по някакъв начин GH се обобщава като непряк инструмент за описване на разпределението на молекулното тегло на хидролизатите, докато продължителната хидролиза е излишна. Почти винаги при високи степени на хидролиза и следователно много по-малки размери на пептиди (Morales et al., 2017). Резултатите са в съответствие с този анализ, но данните се съгласяват, че тази антиоксидантна активност не е непременно еднаква за фракции с подобни GH, постигнати с комбинации от различни нива.
Антиоксидантна активност и GHs в реакции със субстрат и разнообразен ензим
От друга страна, когато се правят промени в първоначалната работна концентрация на субстрата, може да се отбележи, че антиоксидантните дейности ABTS и FRAP имат различно поведение, както е показано на фигури 4 (А и В). В случая на ABTS, от 75 минути се доказват µmolTE на грам протеин (по-висок от 800) без разлики между средните и високите нива на субстрата (фиг. 4А). Тоест, операцията с ниски субстратни концентрации, въпреки че показва относително по-голямо развитие на GHs с течение на времето и дори достига по-високи крайни GHs, не е задоволителна за получаване на пептидни фракции със способността да неутрализират ABTS + катиони. За случая на FRAP на фиг. 4В може да се забележи, че всички хидролизати, достигнати с най-високо ниво на субстрата и тези, съответстващи на крайните времена, в средно и ниско ниво, са били по-големи от 400 µmolTE на грам протеин; задоволителни стойности, ако считаме, че методът не измерва антиоксиданти, които съдържат SH групи, като някои аминокиселини, тъй като те не намаляват ефективно Fe 3+ до Fe 2+ .
Фигура 3: Антиоксидантна активност, измерена чрез (A) ABTS и (B) FRAP в говежди суроватка за различни концентрации на ензим (E0) Vs. GH, със S0 от 10,22 g/L.
В проучванията на Seo et al. (2015), способността за улавяне на свободните радикали от плазмените протеинови хидролизати се обяснява чрез няколко механизма: способността да дарява водород, да стабилизира радикали, да отделя прооксидативни метални йони и вероятно да формира физическа бариера около мастните капчици, използвайки определена аминокиселина . Според Saiga et al. (2003), този антиоксидантен капацитет е свързан със съществуването на няколко аминокиселини като тирозин, триптофан, метионин, лизин, хистидин и цистеин; Въпреки това, не само присъствието на тези аминокиселини може да бъде достатъчно, за да покаже активност, но те също така влияят върху първичната структура на пептидите и тяхната аминокиселинна последователност.
Фиг. 4 Тенденция на антиоксидантна активност, измерена чрез (A) ABTS и (B) FRAP в говежди суроватка за различни концентрации на субстрат (S0) Vs. GH, с E0 от 300 mg/L.
Butré et al. (2012), установи, че за хидролизатите със същите GHs, хидролизатите от 1% говежди суроватка съдържат по-малко непокътнат протеин, отколкото хидролизатите, произведени с по-високи концентрации на субстрат, тъй като афинитетът на ензима към протеина се определя балансът между естествения протеин и това, внедрено в разтвор (Deng et al., 2018). Промените в този баланс може да предполагат промени в механизмите на хидролиза. Доказано е, че афинитетът на непокътнатия протеин е различен при хидролиза с алкалаза за различни концентрации на субстрат, т.е. съставът на тези хидролизати е различен и всъщност това се получава от промени в селективността на ензима при различни условия на операция (Butré et al., 2012). Това може да обясни, от една страна, разликите, показани в антиоксидантните активности, измерени за различни GH при различни нива на субстрата.
Активност на хелатиране на желязо
Фиг. 5 Процент на хелатиране спрямо% GH. Концентрация на субстрата 10,22 g/L, като се използват 300 mg/L ензим
Концентрация на антиоксидантни пептидни фракции
Таблица 3: Сравнение между групи фракции, получени чрез ултрафилтрация след хидролиза с S0 = 10,22 g/L и и ниските и средните нива на ензима, използвани в експеримент "В
В ензимната реакция на хидролиза на LSB с алкалаза има значителен ефект от времето върху антиоксидантния потенциал на суроватъчните хидролизати. Освен това антиоксидантната активност е по-висока при по-ниски ензимни концентрации. С различни нива на ензима, увеличаването на GH благоприятства антиоксидантната активност, измерена по метода ABTS, както и металната хелаторна активност на хидролизатите. От друга страна, при работата на тази реакционна система, с ниски концентрации на субстрат, въпреки че представя по-добри резултати по отношение на GHs с течение на времето, дори достигайки крайни GHs относително по-високи от тези, получени с други нива на субстрата, фракциите пептидни съединения нямат голям потенциал в способността да неутрализира ABTS + катиони. В случая на активността, измерена чрез FRAP, всички хидролизати, достигнати с най-високо ниво на субстрата и тези, съответстващи на крайните времена, в средни и ниски нива, са по-големи от 400 µmolTE на грам протеин, което е задоволително.
AOAC = Асоциация на официалните аналитични химици.
FRAP = антиоксидантна сила на намаляване на желязото.
ABTS = азинобис 3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина.