РАЗДЕЛЕНИЕ и биохимични характеризиране на ензима 1,3 PROPANODIOL OXIDORREDUCTASE идващи от РОДЕН щам на Clostridium SPP IBUN 158 NIXYOLLY АЛЕКСАНДРА CUCAITA Васкес Industrial Микробиолог PUJ код 186286 микробиология университетски институт следдипломна теза за оптимизиране на UNACULTÍA MICROBIROBIOLOGÍA UNIVERSOGRADO УНИВЕРСИТЕТ MICROBIA завършил тезата за UNACULTURAL ИНСТИТУТ ПО БИОЛОГИЯ. ОТ КОЛУМБИЯ БОГОТА DC, КОЛУМБИЯ 2010

разделяне

РАЗДЕЛЯНЕ И БИОХИМИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА НА ЕНЗИМА НА 1,3-ПРОПАНОДИОЛ ОКСИДОРРЕДУКТАЗА ОТ НАТИВЕН ШТАМ Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ Индустриален микробиолог P.U.J. Код 186286 Директор ДОЛИ. Доцент по линия на групата за биопроцеси и биопроспекция „Солвентогенни микроорганизми“ ПОДДИСКУЛАТИВНИ ИНТЕРФАЛЦИИ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕН ИНСТИТУТ ПО БИОТЕХНОЛОГИЯ НАЦИОНАЛЕН УНИВЕРСИТЕТ В КОЛУМБИЯ БОГОТА, ЦИКЛ 2010

На теб, мама, цялата ми благодарност и вечна любов, че ме подкрепяш и винаги си с мен. На дъщеря ми за нейното търпение и любов, на сестра ми, че ми беше безусловен приятел, на Диего и на цялото ми семейство, че беше подкрепата на тази мечта, която днес е реалност.

ПРИЗНАВАНИЯ Д-р Доли Монтоя Кастаньо за ръководството на тази работа, за това, че ми даде възможност да работя с нея и с изследователска група, която допринесе повече от знанията за живота ми. На моите колеги от групата: Джулиет Серано, Ксимена Перес, Наталия Комба, Маурисио Бернал, Херлинда Амарис, Мария Ангелика Пеня, Йени Росио Мартинес, Карлос Бараган, Гернот Грус, Андрес Гутиерес и всички, които по някакъв начин са част от лабораторията по микробиология. На следдипломната интерфакултура по микробиология, особено на Socorro Prieto за нейната подкрепа и сътрудничество. На Джон Флорес, че ми беше като ангел, за сътрудничеството и търпението, благодаря ви много. На Ана Лусия Кастибланко и Хорхе Кортазар за тяхната готовност и помощ. На моите приятели от магистърска степен, особено Вивиан, Мери, Каролина, Оскитар и Алексис, за това, че са толкова добри приятели, че ме подкрепят и винаги са били там, за да ми дадат добър съвет. На Националния университет в Колумбия за възможността за завършване и завършване на това изследване.

СЪДЪРЖАНИЕ РЕЗЮМЕ 1. ВЪВЕДЕНИЕ 1 2. ТЕОРЕТИЧНА РАМКА 3 2.1. Производство на биодизел 3 2.2. 1,3-пропандиол 4 2.3. Синтез на 1,3-пропандиол 5 2.4. Микроорганизми от рода Clostridium sp. 7 2.5. Физиология на образуването на 1,3-пропандиол в Clostridium sp. 7 2.6. Дехидрогеназни ензими 9 2.6.1. Експериментално измерване на ензимната активност 11 2.6.2. Детекция на място на ензимната активност на 1,3-пропандиол дехидрогеназа 11 2.6.3. Получаване на ензими 12 2.6.4. Пречистване на ензими 13 2.6.5. Определяне на общата концентрация на протеин 14 2.6.6. Ензимна характеристика 14 2.7. Напредък на групата за биопроцеси и биопроучване на солунтогенната линия IBUN 16 3. ОБЩА ЦЕЛ 18 3.1. Специфични цели 18 4. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 19 4.1. Микроорганизми, среда и условия на култура 19 4.2. Кинетика на растежа 20 4.3. Получаване на суров протеинов екстракт 20

4.3.1. Производство на суров протеинов екстракт 20 4.3.2. Определяне на протеини по флуорометричен метод 20 4.3.3. Определяне на ензимната активност 21 4.4. Пречистване на 1,3-пропандиол дехидрогеназен ензим 22 4.4.1. Утаяване на протеини 22 4.4.2. Разделяне и пречистване на ензима 22 4.4.3. Проверка на пречистването 22 4.4.4. Анализ на протеини (PAGE) 23 4.5. Характеризиране на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 23 4.5.1. Определяне на оптималната температура 23 4.5.2. Определяне на оптималното рН 23 4.5.3. Определяне на кинетичните параметри Km и Vmax 24 4.5.4. Ефект на двувалентни йони 24 4.5.5. Предварителен тест за определяне на молекулната маса 24 4.5.6. Определяне на изоелектричната точка 25 5. РЕЗУЛТАТИ 26 5.1. Метод за получаване на суров протеинов екстракт 26 5.1.1. Работни щамове 26 5.1.2. Кинетика на растежа 26 5.2. Получаване на суров протеинов екстракт 27 5.2.1. Производство на суров протеинов екстракт 27 5.2.2. Ензимна активност 28 5.2.3. Крива на калибриране за NAD + H 29 5.3. Разделяне и пречистване на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 29 5.3.1. Протеинови валежи 30

5.3.2. Разделяне и пречистване 31 5.3.3. Анализ на протеини (PAGE) 35 5.4. Характеризиране на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 36 5.4.1. Влияние на температурата върху активността на ензима 36 5.4.2. Определяне на оптималното рН 37 5.4.3. Определяне на кинетичните параметри Km и Vmax 37 5.4.4. Ефект на двувалентни йони върху активността на ензима 38 5.4.5. Предварително изпитване за определяне на молекулната маса 39 5.4.6. Определяне на изоелектричната точка на ензима 40 6. ДИСКУСИЯ 41 7. ЗАКЛЮЧЕНИЯ 51 8. ПРЕПОРЪКИ 52 9. БИБЛИОГРАФСКИ РЕФЕРЕНЦИИ 53 10. ПРИЛОЖЕНИЯ 61 10.1. ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Стандартна крива NAD + H 61 10.2. ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Определяне на ензимната активност 63 10.3. ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158B в RCM среда (Oxoid) 64 10.4. ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158 B в среда TGY 65 10.5. ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Крива сухо тегло спрямо абсорбция (600 nm) на Clostridium IBUN 158B в среда TGY 67 10.6. ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Стандартна крива за определяне на молекулната маса на 1,3-пропандиолдехидрогеназа в полиакриламиден гел при денатуриращи условия 68

1,3-пропандиол дехидрогеназа 39 Фигура 19. Процент на активност на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа срещу действието на хлоридни соли 39 Фигура 20. Оценка на молекулната маса на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа в 10% полиакриламид гелове при денатуриращи условия 40 Фигура 21. NAD + H крива и уравнение на линията в спектрофотометъра Bio-Rad 61 Фигура 22. NAD + H крива и уравнение на линията в четеца TECAN ELISA 62 Фигура 23. Кинетика на необходимото време за получаване на по-висока ензимна активност 63 Фигура 24. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158B в RCM 64 Средна Фигура 25. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158B в среда TGY 66 Фигура 26. Крива на сухо тегло Vs Абс 600 nm на Clostridium IBUN 158B в TGY 67 среда Фигура 27. Стандартна крива на молекулна маса, използвана за оценка на масата на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа, оцветена с Coomassie Blue 68 Фигура 28. Стандартна крива на молекулна маса, използвана за това Намалете масата на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа от Zymogram 68

Таблица 17. Кинетични параметри, получени от кривата на сухото тегло (g/l) спрямо Abs (600 nm) 67

3. ОБЩА ЦЕЛ: Получаване, разделяне и характеризиране на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа от естествения щам на Clostridium IBUN 158 B. 3.1. СПЕЦИФИЧНИ ЦЕЛИ: Да се ​​стандартизира метод, който позволява получаването на суров протеинов екстракт от култура на местния щам Clostridium IBUN 158 B, от Института по биотехнологии на Националния университет в Колумбия. За да се оценят методите на разделяне чрез гел филтрация и йонен обмен в FLPC система за отделяне на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа от щама Clostridium IBUN 158 B. Определете ензимната активност, pH, оптимална температура, кинетични параметри, маса молекулна и ефект на йоните върху активността на ензима пречистена 1,3-пропандиол дехидрогеназа 18

Предварително боядисани A 178 B 120 C 78 D 51 E 40 F 25 G 18 H 12 I 10 4.5.6. Определяне на изоелектричната точка Теоретично беше определена, като се вземе предвид протеиновата последователност, получена от Montoya (2008b) за ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа, публикувана в базата данни на NCBI за Clostridium IBUN 158B и инструментът за биоинформатика беше използван от института EMBnet биотехнология за изчисляване на изоелектричната точка на ензима. 5. РЕЗУЛТАТИ 5.1. Метод за получаване на суров протеинов екстракт 25

5.2. Получаване на суров протеинов екстракт 5.2.1. Производство на суров протеинов екстракт Тъй като ензимът, който представлява интерес за това изследване, е вътреклетъчен, приготвянето на протеини от Clostridium IBUN 158B се извършва чрез обработка с ултразвук, както е описано в материалите на метода. Беше забелязано, че с увеличаването на циклите броят на непокътнатите микроорганизми намалява и клетъчните отломки се увеличават, което беше представено поради процеса на лизис, който клетките претърпяха (Фигура 8). Фигура 8. Грам оцветяване на естествени щамове Clostridium. IBUN 158B след всеки от циклите и времената на ултразвук. Тест, извършен при 4 ° С, 60 KHz, с периоди от време от 30 секунди. Клетките бяха подложени на няколко обработки с ултразвук и беше установено, че оптималните условия за получаване на хомогенност и по-голямо производство на протеин в пробите са постигнати в цикъл 12 с 30 секунди ултразвук, 27 пъти почивка

1 2 3 4 Фигура 13. Оцветяване на синьо. Денатуриращи условия при 10%. Кладенец 1: Отрицателен контрол, Кладенец 2: Положителен контрол, Кладенец 3: Чист 1,3-PDD ензим, Кладенец 4: 190 KDa MP. 5.4. Характеризиране на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 5.4.1. Влияние на температурата върху активността на ензима Като предварителен тест за избора на диапазон от температури, които трябва да бъдат оценени, ензимната активност на пробите се определя в два екземпляра, в диапазон от температури, вариращи от 20 до 40 С. получените резултати показаха по-голяма ензимна активност при температура от 30 С. От тези резултати беше оценен по-тесен диапазон от температури, установен между 25 C и 31 C (фигура 14), който ни позволи да потвърдим откритото в първия тест. Фигура 14. Влияние на температурата върху ензимната активност в температурен диапазон от 25 до 31 С. 5.4.2. Определяне на оптималното рН Изборът на диапазоните на рН, които трябва да бъдат оценени, е направен, като се вземат предвид проучванията, при които е оценен този вид ензим. На (фигура 15) ефектът, че 36

Фигура 16. Ефект на концентрацията на 1,3-пропандиол в mm върху активността на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа, като се използва концентрация NAD + от 0,6 mm Фигура 17. Ефект на концентрацията на NAD + коензим върху активността на ензим 1,3-пропандиол дехидрогеназа, като се използва концентрация на 1,3-пропандиол 100 mm 5.4.4. Ефект на двувалентните йони върху ензимната активност На фигури 18 и 19 е показан ефектът, генериран от хлоридни соли и тяхната концентрация върху активността на пречистения ензим, ясно може да се види, че солите на манганов хлорид и калциевият хлорид са активатори и потенцират 38

ензимна активност, докато солите на магнезиевия хлорид потискат неговата активност с до 19%. Манганов хлорид увеличава активността на ензима с 50% в сравнение със 7%, генерирани от калциев хлорид Фигура 18. Ефект на двувалентни йони върху активността на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа Фигура 19. Процент на активност на ензима 1,3 -пропандиол дехидрогеназа срещу действието на хлоридни соли. 5.4.5. Предварителен тест за определяне на молекулната маса Като се вземат предвид резултатите от електрофорезата, получена след процеса на пречистване и като начин за определяне на приблизителната молекулна маса на ензима, стойностите в mm на пътя на лентите в гел, като се използва уравнението на линията, получена от размера на лентите на маркера за тежест 39

(190 KDA) върху 10% полиакриламидни гелове (Фигура 20). Полученият резултат е маса от 71,3 KDa за единичната лента в гел, оцветена с Coomassie Blue и от 74,5 KDa за лентата, доказана в зимограмата. 1 2 3 4 1 2 3 4 71,3 KDa 74,5 KDa (a) (b) Фигура 20. Оценка на молекулната маса на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа в 10% полиакриламидни гелове при денатуриращи условия (a) Оцветени с Coomassie Blue ( б) Зимограма. Кладенците (1) съдържат маркера за тегло 190KDa (Bioline), а кладенците (2-4) съдържат ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа след процеса на пречистване. 5.4.6. Определяне на изоелектричната точка на ензима Според резултатите, получени с помощта на инструменти за биоинформатика; теоретичната пи, генерирана от 385 аминокиселини, получена от последователността, установена от Montoya (2008b) за ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа от Clostridium IBUN 158B, е 5,85 40

7. ЗАКЛЮЧЕНИЯ Беше възможно да се установи, че ензимът 1,3-пропандиол дехидрогеназа от естествения щам Clostridium IBUN 158B проявява алостерично поведение, което съвпада с биоинформативни данни, получени от групата Bioprocess и което е в процес на публикуване. Ензимната активност е силно повлияна по време на ферментацията от фактори като рН и производството на киселина, които са свързани с потока на редуциращи агенти като NAD + H. Оптималните условия за получаване на по-висока ензимна активност бяха постигнати при температура 30 ° С, рН 10,0, концентрация на MnCl 2 1 mm, 1,3-PD 100 mM и NAD + 2 mm. Беше показано, че резултатът, получен за изчислената молекулна маса в рамките на това проучване, не е надежден, поради което се препоръчва да се потвърди чрез гел-филтрационна хроматография и масспектрометрия. 51

8. ПРЕПОРЪКИ Необходимо е да се пречисти и характеризира ензимът глицерол дехидратаза, тъй като той също играе важна роля в трансформацията на глицерол в 1,3-пропандиол. Управлявайте контролирани условия на ферментация, които позволяват да се генерират по-високи стойности на ензимната активност, без да се влияе от производството на киселини в процеса на ферментация на флакона. За да се изясни поведението на метаболитния поток в рамките на глицероловия път, се препоръчва да се извърши анализ на ензимната активност по отношение на производството на киселини. За да се увеличи активността на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа от естествения щам C. IBUN 158B, е необходимо да се използват някои микроелементи като MnCl 2 и CaCl 2 в процесите на ферментация с TGY среда и RCM 52