ISSN 1025 - 5583
Том 57, Nê 2 - 1996

никотинамид


Ефект на никотинамид върху загубата на течности при холера

Фабибн Мендоса 1, Ренцо Леун 1

Холерата у нас генерира важни проблеми в областта на общественото здраве. Понастоящем се лекува чрез възстановяване на загубения обем и елиминиране на V. cholerae, но не блокиране действието на токсина. Има доказателства, че никотинамидът ще действа върху токсина чрез намаляване на секрецията на вода и електролити.

Способността на никотинамид да намалява загубата на течности е оценена при зайци с холера; с помощта на рандомизирано експериментално проучване.

Никотинамид е прилаган на 10 здрави зайци, количествено определящ екскретите им (g/ден), преди и след приложението, за да се изключат ефекти, които променят интерпретацията на резултатите; не са открити статистически значими разлики (p = 0,3). След 5 дни, за да се осигури елиминиране на лекарството, зайците бяха заразени чрез разделяне на 2 групи от по 5; Когато се появи диария, ние прилагаме никотинамид и плацебо, съответно, количествено определяме изпражненията (g/ден), като установяваме статистически значима разлика (p

Ключови думи: Никотинамид, холерен токсин, нуклеутиден гуанинов регулаторен протеин, цикличен AMP.

ЕФЕКТ НА НИКОТИНАМИД ВЪРХУ ЗАХРАНИТЕ НА ХОЛЕРНА ТЕЧНОСТ

Холерата е причинила големи проблеми с общественото здраве у нас. В момента терапевтичният подход се състои от двете, възстановяване на загубения обем и елиминиране на микроорганизма; няма обаче никаква терапевтична интервенция, която да блокира токсинното действие. Има доказателства, сочещи, че никотинамидът може да действа върху токсина, намалявайки загубите на вода и електролити.

В тази работа способността на никотинамид да намалява загубите на течности при заразени с холера зайци е анализирана чрез рандомизирано експериментално проучване. Десет предишни здрави зайци получиха никотинамид; масата на изпражненията (g/ден) преди и след приложението на никотинамид бяха оценени, за да се изключат всякакви странични ефекти, които могат да променят резултатите. Няма значителни разлики в масата на изпражненията (g/ден) преди и след приложението на никотинамид (p = 0,3). Зайците са заразени с V. cholerae 5 дни по-късно (за осигуряване на елиминирането на никотинамид); след това бяха разделени на две групи (A и B) и пет случайно разпределени за всяка група. Когато се появи диария, зайци от група А получават никотинамид, а зайци от група В получават плацебо. Масата на изпражненията е количествено определена и в двете групи, показваща значителна разлика (стр

Нашето проучване показва, че никотинамидът намалява загубите на течности, причинени от холера, и отваря нов път на терапия.

Ключови думи: Никотинамид, холерен токсин, G-протеини, цикличен AMP.

ВЪВЕДЕНИЕ

Холерата е остро заболяване на храносмилателната система, което измъчва човечеството от незапомнени времена (1,2), имащо значение поради своята универсалност и висока смъртност. По този начин той е пристигнал у нас два пъти, последният е през 1991 г. (1.4).

Това заболяване се проявява чрез образуване на обилна водниста диария, която за кратко време води до дехидратация и хиповолемия, върху която се върти клиничната картина, която, ако не се лекува навреме, може да доведе до шок и смърт (2,5).

Стратегиите за лечение през настоящия век са били ориентирани към възстановяване на загубения обем и поддържането му; (3,5,6) обаче досега няма ефективен начин за значително намаляване на времето на заболяване, приложим за всички пациенти, въпреки употребата на антибиотици като тетрациклин, (7) които унищожават Вибрион холера но не и към неговия токсин, който е отговорен за загубата на течности (8).

След като холерният токсин (TC) проникне в ентероцита, той действа върху алфа субединицата на хетеротримерния протеин G (отговорен за транслацията на извънклетъчните сигнали във вътреклетъчните отговори), катализирайки свързването на цитоплазматичната ADP-рибоза към споменатата субединица, реакция, наречена ADP рибозилиране. Това свързване води до трайно активиране на аденил циклаза, което от своя страна повишава нивата на сАМР, увеличавайки секрецията на вода и електролити (виж Схема № 1). И така, за T.C. активира протеина G, необходимо е включването на молекула ADP-рибоза в алфа субединицата (8,9,10).

До преди малко нямаше начин да се блокира този процес, тъй като не можеше да действа терапевтично на това ниво. Доказано е обаче, че никотинамидът (NCT) и неговите производни намаляват вътреклетъчните нива на сАМР, които, както обяснихме, са от съществено значение за производството на диария (8,11).

По този начин ние вярваме, че тази терапевтична възможност не трябва да се пренебрегва, което за разлика от използваните досега неутрализира начина на действие на токсина.

По този начин проведохме това експериментално двойно-сляпо проучване, в което демонстрирахме антитоксиновия ефект на NCT, чрез намаляване на загубата на течности при зайци, заразени V. холера.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Това проучване е проведено в Института по тропическа медицина към Universidad Nacional Mayor от Сан Маркос, който разполага с лаборатории, оборудвани за изследователски цели, както и детска стая за грижа за опитни животни, в периода от 21 август до 23 септември, 1995 г. Използвахме 10 зайци от породата "Нова Зеландия", които отговарят на следните критерии за подбор:

а) Мъже, без очевидни заболявания, активни и в привидно добро общо състояние.

б) Тегло: между 1000 - 1200 g.

в) Възраст: между 1,5 - 2,0 месеца.

По този начин стандартизираме пола, възрастта и теглото, тъй като чревната повърхност, върху която ще действат както CT, така и NCT, зависи от споменатите фактори.

  • Тези животни са получавали подобни дажби твърда храна: Conejina (Industrias Purina S.A., Лима - Перу) и Alfalfa (Medicago sativa) и течности ad libitum по време на изпълнение.
  • Използва се NCT с чистота 99,9% (Laboratorios ROCHE), който се разделя на дози от 100 mg.
  • Щамът на V. холера използван е каталогизиран като Вибрион холера O: 1 биотип El-Tor, множество серотипове (Ogawa и Inaba); е изолиран и култивиран по стандартни бактериологични методи и осигурен от Катедрата по микробиология на Universidad Nacional Mayor от Сан Маркос.

Тъй като бихме демонстрирали антитоксинния ефект на V. холера, Ние извършваме тази работа на 2 етапа. Първият има за цел да провери дали NCT не води до промени в теглото на екскретите на здрави животни, а вторият има за цел да демонстрира сравнително намаляването на загубата на течности при заразени животни (лекувани с NCT срещу нелекуван контрол).

Преди да започнем тези етапи, решихме да "елиминираме" чревната флора на животните с приложението на еноксацин (второ поколение хинолон, който покрива широк спектър от грам (+) и грам (-) при относително нисък MIC), при 2 доза от 20 mg всяка с интервал от 12 часа. Това беше направено, за да се съкрати времето за инкубация на V. холера, че при наличието на защитна флора при зайци е приблизително 1 седмица (според нашето пилотно проучване), което затруднява внимателното им наблюдение. Изчакахме 5 дни, за да осигурим елиминирането му.

1-ви етап: Ефект на NCT върху теглото на екскретите при здрави животни

За да се изключат други ефекти на NCT, които пречат на събирането на данни и интерпретацията на резултатите, 100 mg NCT се прилага перорално на всеки от 10-те зайци, определяйки количествено теглото на изпражненията на ден преди и след приложението.

Изчаква се 5 дни, за да се гарантира елиминирането на лекарството, преди да се премине към следващия етап.

2-ри етап: Ефект на NCT върху теглото на екскретите при заразени животни

Преди този процес 10-те зайци, поставени в отделни метаболитни клетки, бяха разделени на 2 групи от 5 зайци (А и В), като се използва таблицата на случайните числа.

10-те зайци бяха инокулирани с гореспоменатия щам, отгледани в хранителен бульон и инкубирани в продължение на 8 часа при 37 ° С, докато се постигне мътност, подобна на №3 по скалата на Mac Farley, с помощта на визуален сравнителен метод. Приложеното количество е 1 ml. от заек V.O.

Когато наблюдавахме появата на диария (приблизително 16 часа след инокулацията), на експерименталната група (А) беше приложена доза NCT, орално разтворена в 1 ml дестилирана вода. На контролната група (В) се прилага само 1 ml дестилирана вода.

Количественото определяне на екскретите ще се извърши от момента на приложение на NCT и съответно вода за период от двадесет и четири часа, като се обозначава като група А и В, изследователят, който е определил количеството екскременти е неизвестен, което съответства на група, лекувана с NCT и която към плацебо групата.

Проверка за инфекция от V. холера, извършено е върху ректално тампониране със стандартни бактериологични методи.

За анализ на статистическата значимост в асоциацията и анализ на средствата е използван параметричният тест на дисперсионния анализ (ANOVA 1 WAY), за който са изпълнени критериите за случайност, нормалност и хомогенност на дисперсиите. Нивото на значимост (алфа) се счита за статистически значимо

Базата данни е разработена в статистическата програма MSTAT-C. Данните бяха обработени на 486 DX2 микрокомпютър, съвместим с IBM. Резултатите от теглото на изпражненията (непрекъснати променливи) се отчитат като средно ± стандартно отклонение, в грамове.

Етап 1: Ефект на NCT върху теглото на екскретите при незаразени животни

  • Стойностите, получени в теглото на екскретите на 10 здрави зайци, преди прилагане на NCT, са били 35,66 ± 4,09.
  • Стойностите, получени в теглото на екскретите на 10 здрави зайци, след прилагане на NCT, са 35,15 ± 3,92.
  • Тъй като са сходни и двете стойности (преди и след приложението), не е установена статистически значима разлика (p = 0,3).

2-ри етап: Ефект на NCT върху теглото на екскретите при заразени животни

Въз основа на факта, че групите A и B не са показали статистически значими разлики по отношение на теглото на екскретите в изходни условия (група A = 35,66 ± 4,09, група B = 35,15 ± 3,92) (p = 0,3). Пристъпихме към количествено определяне на екскретите и в двете групи след представяне на диария, като установихме статистически значими разлики между групата, лекувана с NCT, и контролата (61,02 ± 6,84 срещу 87,2 ± 3,51 съответно) (p

Допълнително наблюдение е, че не е имало намаляване на продължителността на диарията и в двете групи.

Получените резултати показват, че приложението на NCT намалява загубата на течности при животни, заразени с холера.

На първия етап е показано, че NCT не променя обема на изпражненията при здрави животни, тъй като не е установена статистически значима разлика (p = 0,3) между изпражненията в дните преди и след приложението на NCT.

* Няма значителна разлика между двете групи (p = 0,3)

Във втория етап антитоксинният ефект на NCT се проверява при заразени зайци, като се установява статистически силно значима разлика (p

Таблица № 2.- Ефект на никотинамид спрямо плацебо върху загубата на течности при заразени с холера животни
Група
Зайци 		Тегло на изпражненията (гр/ден) Средно ± SD
1 две 3 4 5
(A) NCT 91.5 82.6 89.4 85,0 87.5 87,20 ± 3,51
(Б) Плацебо 52.6 62.7 62.3 70.7 56.8 61,02 ± 6,84

* Силно значимо (стр

Както обяснихме, NCT би повлиял на молекулярния механизъм на действие на CT на недостатъчно дефинирано ниво (2), но това, което е ясно е, че намалява високите нива на cAMP в засегнатите ентероцити (11).

Нашите резултати могат да бъдат обяснени с биохимичното действие на NCT, както следва:

а) NCT би конкурентно инхибирал ADP-рибозилирането на Gs алфа.

б) NCT ще се свърже с субединицата A1 на TC, инактивирайки действието си (виж Схема № 2).

Тези хипотези трябва да бъдат потвърдени с бъдещи изследвания на молекулярно ниво, тъй като те контрастират с мнението на някои автори, които смятат, че NCT може да обърне процеса на ADP-рибозилиране, което ни изглежда малко вероятно, тъй като разбира образуването на ковалентна връзка. ( необратим).

Въпреки прилагането на NCT обаче, експерименталната група показа диария, макар и с по-малък размер (изразена в тегло).

Това може да се обясни поради съществуването на йонни канали, които не биха се активирали от сАМР, където токсинът би действал директно. Освен V. холера произвежда други токсини като Zone Occludens Toxin (ZOT), което увеличава пропускливостта между ентероцитите и тези, които медиират действието на простагландини и невротрансмитери, които повишават чревната подвижност (9).

По този начин експериментално демонстрирахме полезността на NCT при загубата на течности поради холера при зайци от новозеландска порода и сме убедени, че по-задълбоченото проучване на този нов терапевтичен агент ще допринесе за настоящата схема на лечение, която е имала много важен напредък през последния век.

БЛАГОДАРНОСТ

Нашите искрени благодарности за съветите, предоставени от д-р José Chumpitaz от Института по тропическа медицина Daniel A. Carriun - UNMSM.