- Обобщение
- Въведение
- Резултати
- Идентифициране на фосфопротеини в SNU216 и SNU216-LR клетки
- Мрежов анализ и количествено определяне на диференциално фосфорилирани протеини
- Ефекти на целевите противоракови средства върху SNU216-LR клетки
- Дискусия
- Допълнителна информация
- Файлове с изображения
- Допълнителна фигура 1
- Допълнителна фигура 2А
- Допълнителна фигура 2Б
- Допълнителна фигура 3
- Допълнителна фигура 4
- Допълнителна фигура 5
- PDF файлове
- Допълнителна таблица 1
- Допълнителна таблица 2
- Допълнителна таблица 3
- Word документи
- Допълнителна информация
Обобщение
Въведение
Рецепторът за човешки епидермален растежен фактор 2 (HER2) е една от рецепторните тирозин кинази, активирани чрез димеризация с членове на семейството на рецепторите за епидермален растежен фактор (EGFR). 1 Свръхекспресията на HER2 води до прогресия на тумора чрез вътрешноклетъчни каскади за трансдукция на сигнала 2 и се наблюдава при ~ 20-30% от рисковите случаи на рак на гърдата, 3, 4, както и при 6 -35% от инвазивните ракове на стомаха. 5 Лапатиниб инхибира пролиферацията на ракови клетки, които свръхекспресират EGFR и/или HER2 както in vitro, така и in vivo, и е одобрен от Американската администрация по храните и лекарствата като лечение за напреднал HER2-положителен рак на гърдата през 2007 г. 6,7,8 The антитуморната активност на лапатиниб също е изследвана в ракови клетки на стомаха. 9,10 Понастоящем се провежда клинично изпитване фаза III, сравняващо ефекта само на химиотерапията спрямо комбинацията с лапатиниб при пациенти с HER2-позитивен рак на стомаха. 11 Придобитата резистентност към лапатиниб обаче е била и продължава да бъде ограничение за терапевтичната му употреба в клиниката поради лошото разбиране на основните механизми.
Резултати
Идентифициране на фосфопротеини в SNU216 и SNU216-LR клетки
За да изследваме възможните механизми, отговорни за придобиване на резистентност към HER2-насочена терапия при рак на стомаха, установихме LR клетъчна линия (SNU216-LR) чрез хронично излагане на HER2-положителни клетки SNU216 (лапатиниб-свръхчувствителни ракови клетки на стомаха) на нарастващи концентрации на лапатиниб. ин витро за 8 месеца. Беше избран и характеризиран един LR клетъчен клон (SNU216-LR). Стойността на полумаксималната инхибиторна концентрация в SNU216-LR клетки е> 10 μM, което е 500 пъти по-високо от това на родителските клетки (0,02 μM).
След това извършихме мащабен количествен анализ на фосфопротеома, за да идентифицираме диференциално фосфорилирани протеини (DPP) между клетки SNU216-LR и SNU216. MS анализ на обогатени с TiO 2 фосфопептиди (протеин: вероятност> 99% и FDR 80% и FDR 20) Нашият подход идентифицира 7791 места за фосфорилиране (Ascore> 80%) сред 11 852 уникални места за фосфорилиране (Допълнителна таблица 3) Серинът беше е установено, че е най-обилно фосфорилираният остатък (9745 места, 82%), последван от треонин (1763 места, 15%) и тирозин (344 места, 3%) (допълнителна фигура 1В). Възпроизводимостта на откриването на същите протеини в три екземпляра анализът чрез LC-MS/MS надвишава 91% и за двете клетъчни линии (допълнителни фигури 1C и 1D).
За да оценим количествените промени във фосфорилирането на всеки фосфопептид, ние избрахме за DPP в клетки SNU216-LR, използвайки метода на спектрално броене на скеле (версия 3.4.9). Съотношението сигнал/шум и P-стойностите за DPP са получени с помощта на PLGEM. Списък със 95 значително регулирани фосфопротеини (P
Диференциално експресирани фосфопротеини в SNU216-LR и техните функционални анотации. ( да се ) Вулканичен график, показващ P-стойност (-log 10) спрямо съотношението сигнал/шум (S/N) на фосфопротеините, определен чрез статистически анализ на модела на глобалната грешка (PLGEM) за немаркирано количествено определяне. ( б ) Молекулярни функции на фосфопротеините, идентифицирани от инструмента за анализ на интензивността на пътя (IPA). ( ° С ) Клетъчна локализация на фосфопротеините, идентифицирани от инструмента IPA.
Изображение в пълен размер
По-нататък ние оценяваме количествените промени във фосфорилирането на протеини, като използваме методи за количествено определяне без етикет (MS/MS спектрален брой и екстракционна йонна хроматография), които са общоприети във фосфопротеомичните изследвания. 22, 23, 24 Повече MS/MS спектрални преброявания на фосфорилирани EGFR и HER2 пептиди са идентифицирани в SNU216-LR, отколкото в SNU216 клетки (допълнителни фигури 2А и 2В). Тези данни са в съответствие с екстрахираната с пептид йонна хроматограма, която показва значително по-висок интензитет на сигнала на фосфорилирани пептиди в клетки SNU216-LR (допълнителни фигури 2С и 2D). Използвайки същите подходи за количествено определяне, успяхме да измерим нивата на фосфорилиране на ключови молекули (MET, RAS, C-RAF, ERK1/2, PI3K и AKT; вж. Допълнителните фигури 2E-J). Освен това открихме ново място за фосфорилиране в HER2 (S1073) въз основа на референтната база данни за фосфопептиди phosphoSitePlus (www.phosphosite.org). Това място на фосфорилиране е потвърдено от съвпадащите тандемни мас спектри, показани на допълнителна фигура 3.
Мрежов анализ и количествено определяне на диференциално фосфорилирани протеини
За да проучим степента, до която активирането на сигналните пътища допринася за терапията, насочена към EGFR/HER2, ние интегрирахме DPPs (P
Анализ на биологичните мрежи на фосфопротеините. Асоциациите между фосфопротеините са показани с плътни или пунктирани линии, представляващи съответно директни или индиректни взаимодействия. Нерегулираните протеини са показани в червено, а отрицателно регулираните протеини са в зелено.
Изображение в пълен размер
Нашият анализ на резултатите от инструмента IPA също разкри, че сигналните пътища EGFR/HER2, MET и ERK/MAPK са обогатени (допълнителна фигура 5). Въз основа на резултатите от анализа на мрежата и каноничния път за сигнализация, ние изградихме сигналната мрежа за EGFR/HER2 и MET с двата основни сигнални пътя надолу по веригата (PI3K/AKT и MAPK/ERK), включително SRC. (Фигура 3) . Както е показано на Фигура 3а, категоризирането на нивата на експресия на специфични фосфорилирани места разкрива, че повечето от сигналните молекули са силно експресирани в SNU216-LR. Също така сравнихме SNU216 и SNU216 LR, както и три други устойчиви клонинги (SNU216-LR1, 2 и 3), използвайки имуноблот анализ с фосфо-специфични антитела. Според количествените резултати от MS, нивото на фосфорилиране на избрани протеини (EGFR, HER2, MET, AKT, MAPK, SRC и RAF) се е увеличило в SNU216-LR (Фигура 3b).
Изображение в пълен размер
Ефекти на целевите противоракови средства върху SNU216-LR клетки
Антипролиферативни ефекти на избрани инхибитори на тирозин киназа върху SNU216-LR. Клетките SNU216-LR бяха третирани чрез единично или комбинирано третиране на лапатиниб (Lap; 1 μM), NVP-BEZ235 (BEZ; 100 n M), селометиниб (Selu; 1 μM), саракатиниб (Sara; 1 μM) и кризотиниб (Crizo; 1 цМ). ( да се ) Жизнеспособните клетки бяха измерени след 72 часа. Процентът на жизнеспособните клетки е показан спрямо необработените контроли. Данните представляват средна стойност ± sd (* P 9 В момента продължава клинично изпитване фаза III при пациенти с напреднал рак на стомаха, изучаващо ефектите на лапатиниб в комбинация с капецитабин плюс оксалиплатин. 26 Интересът към това проучване отразява, че лапатиниб се счита за един от обещаващите химиотерапевтични лекарства за лечение на рак на стомаха. От друга страна, средната продължителност на реакцията към лапатиниб е 27 Следователно, разбирането на механизмите на резистентност към придобития лапатиниб може да помогне за подобряване на терапевтичната ефикасност на лапатиниб при HER2 позитивни ракови заболявания.
След като установихме конститутивно активиране в LR стомашни ракови клетки на сигналните пътища PI3K/AKT и MAPK/ERK, както и SRC активиране, ние предположихме, че конститутивното активиране на PI3K/AKT и MAPK/ERK дава устойчивост на лапатиниб и може да бъде медиирано от Сигнализация по оста MET по двата основни пътя надолу по веригата. Нашите данни са съвместими с идеята за компенсаторно активиране на сигналния път надолу по веригата, медииран от MET в отговор на EGFR блокада. 30, 31 Резултатите от няколко проучвания показват, че активирането на MET е свързано с първична и придобита резистентност към EGFR инхибитори при недребноклетъчен рак на белия дроб. 14, 15, 32, 33 Следователно постулираме, че конститутивното активиране на сигналните пътища PI3K/AKT и MAPK/ERK на оста MET, включително странично активиране на SRC, е компенсаторна сигнална каскада, която противодейства на селективното налягане върху EGFR/HER2 при LR човешки стомашни ракови клетки.
В настоящото проучване установихме, че лечението с лапатиниб и кризотиниб може да предизвика чувствителност към лапатиниб. Следователно, активните PI3K/AKT и MAPK/ERK сигнални пътища, индуцирани от оста MET, могат да бъдат критично компенсаторно вътреклетъчно събитие за оцеляването на LR клетките. 28 Доколкото ни е известно, настоящото проучване е първият мащабен профил на пептидно/протеиново фосфорилиране в клетъчните линии на рака на стомаха за изследване на резистентността към лапатиниб. Нашият полуколичествен и специфичен за даден сайт подход показва полезно приложение на биоинформатиката, а фосфопротеомните данни от проучването предоставят информация, пряко свързана с механизмите за резистентност към лапатиниб.
В заключение показваме, че глобалният фосфопротеомичен анализ, базиран на мрежата, е надежден подход за прогнозиране на клетъчни сигнални събития в LR стомашни ракови клетки. Нашите резултати предполагат, че управляваните от MET PI3K/AKT и MAPK/ERK клетъчни сигнални пътища допринасят за резистентността към лапатиниб и съставните сигнални молекули могат да бъдат потенциални цели за развитието на допълнителни терапевтични възможности. Следователно, валидността на сигналните пътища на оста MET PI3K/AKT и MAPK/ERK трябва да бъде оценена с помощта на клинични проби и ще бъде предмет на допълнително проучване.