Кратко описание

1 Еволюционна динамика на РНК вируса Самуел Ойоснегрос Мартос 14 ноември 2008 г. ДОКТОРСКА ТЕЗА Universidad Aut & o.

динамика

Описание

Еволюционна динамика на РНК вируси Самуел Ойоснегрос Мартос 14 ноември 2008 г.

ДОКТОРАЛНА ТЕЗА Universidad Aut´ onoma de Madrid Факултет на науките Департамент по молекулярна биология

Доклад, представен от завършилия биология Самуел Ойоснегрос Мартос, за да кандидатства за докторска степен от Автономния университет в Мадрид. Мадрид, ноември 2008 г.

Работата, представена в тази докторска дисертация, е извършена в Центъра за молекулярна биология "Severo Ochoa", под ръководството на д-р Естебан Доминго Соланс и е финансирана от докторантска стипендия за университетско обучение на кадри (FPU) на Министерството на образованието и наука.

На Серджо На моите родители

Благодаря на всички ви. РНКазите не съществуват, тотална наука. тотална наука.

SBF: Фетален говежди серум SDD: Зависима от плътността селекция SPC: Поликлонален серумен СПИН: Синдром на придобита имунна недостатъчност ST: Стандартен геном 5 'UTR и 3' UTR: Непреведени региони на 5 'и 3' края, съответно VFA: Foot- вирус на болестта на устата и устата HCV: Вирус на хепатит С HIV-1: Вирус на човешка имунна недостатъчност тип 1 VSV: Вирус на везикуларен стоматит ∆: Делеция

ACM: моноклонално антитяло AZC: 5-азацитидин (AZC) BHK-21: бъбречни клетки на хамстер (бъбрек на бебе хамстер) cDNA: ДНК копие d: средно разстояние DEAE: диетил аминоетил Df: степени на свобода, степени на свобода DIs: дефектни смущаващи частици DMEM: Модифицираната от Dulbecco's Eagle минимална ДНК: Дезоксирибонуклеинова киселина dNTP: 2'-деоксинуклеозид-5'-трифосфат ecp: Цитопатичен ефект EDTA: Етил В диамин тетрацетат FA: болест на шап FU: 5-Флуороурацил G: Гуанидининум hpe: Часове след електропорация IRES: Вътрешно място за влизане на рибозома Kb, Pb: Килобази, базови двойки LCMV: Миши лимфоцитен хориоменингит вирус M: Моларен MDI: Множество инфекция MP: Максимална парасимония MV: Максимална вероятност NJ: присъединяване на съседи nt: Нуклеотид PAQ: Анализ на разпределението на квазивидовете PBS: Буфериран с фосфат физиологичен разтвор PCR: Полимеразна верижна реакция PFU: D-образуващи единици плоча PolyA: Полиаденилат PolyC: Полицирибоцитидилат PV: Полиовирус R: Рибавирин ´ РНК: Рибонуклеинова киселина RpRd: РНК полимераза зависима РНК RT: Ретро транскриптаза RT-PCR: Реакция на обратна транскрипция, последвана от SARS полимеразна верига: Остър тежък дихателен синдром

Код на аминокиселината A (Ala) Аланин I (Ile) Изолевцин R (Arg) Аргинин C (Cys) Цистеин K (Lys) Лизин S (Ser) Серин D (Asp) Аспартичен L (Leu) Левцин T (Thr) Треонин E (Glu) Глутамин M (Met) Метионин V (Val) Валин F (Phe) Фенилаланин N (Asn) Аспарагин W (Trp) Trypt´ ofano G (Gly) Глицин P (Pro) Пролин Y (Tyr) Тирозин H (His ) Хистидин Q (Gln) глутамин

Индекс 1. Резюме (резюме на английски)

15 15 15 15 17 17 18 19 19 21 22 23 24 25 25 25 26 28

4. Материали и методи 4.1. Еукариотна клетъчна култура. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Използвани варианти на VFA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Инфекции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1. Инфекции в течна среда на клетъчни монослоеве. . . . . . . . . . . . . 4.3.2. Покриване на вируса върху полутвърда агарова среда в клетки BHK-21. . . . . . 4.3.3. Корекция на титъра при нанасяне на популации от дефекти, които заразяват чрез допълване на два вида частици . . . . . . . . . . .

28 30 30 30 30 31 31 31 32 33 33 34 37

40 40 40 41 41 42

43 43 43 43 44 44 44 44 45 45 45 45 45 45 46 46 46 46 49 49 50 51 51 51 52 52 52 54 54 56 56 56 57 57 57 57 58 58 59 59

112 112 113 113 114 114

. 114. 115. 115. 116. 116. 117. 117. 118. 118 . . . . . . .

119 120 121 121 121 122 123 123

8. Филогенетично приложение

9. Математическо приложение: основен модел на вирусна динамика в 9.1. Съревнование на два вируса в клетъчната култура. . . . . . . . . 9.2. In silico динамика спрямо in vitro динамика. . . . . . . . . . . 9.2.1. Първоначални условия. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2.2. Определяне на количеството на вируса. . . . . . . . . 9.2.3. Моделни прогнози и експериментални резултати. 9.3. Параметри на модела. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4. Математически анализ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.1. Закон за опазване. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.2. Пространство на параметрите . . . . . . . . . . . . . . . . . .

128 129 129 131 131 132 132 134 134 134 135

10. Компютърно приложение 136 10.1. Програмен код . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 11. Библиография

Резюме (резюме на английски)

Генетична променливост на РНК вируси Молекулярни основи на генетична променливост на РНК вируси.

Честоти на мутации

Относителна биологична ефикасност

Фигура 1: Схема на квазивидовата структура на РНК вирусите. Централната диаграма представлява хетерогенно разпределение на геномите, типично за РНК вирусите. Редовете представляват вирусни геноми, а символите над редовете представляват мутации. Под спектъра на мутантите е посочен консенсусът или средната последователност на разпределението. Първоначалните квазивидове, в центъра, могат да се развият към увеличаване на биологичната ефикасност (широка стрелка), когато са подложени на пасажи с големи размери на популацията, или към намаляване на биологичната ефективност (малки стрелки), когато са подложени на последователни тесни места на популацията или плоча към плоча преминава. Страните с големи размери на населението благоприятстват конкуренцията между вариантите и водят до увеличаване на относителната биологична ефикасност на вируса. Преходите от плоча до плоча водят до стохастично натрупване на вредни мутации и намаляване на относителната биологична ефективност на вируса.

Lahue 1996). Освен това, РНК полимеразите са склонни към приплъзване чрез копиране на хомополимерни участъци, причинявайки делеции и вмъквания (Bebenek и Kunkel 1993). Съществуват и някои семейства клетъчни протеини, цитозин и аденозин дезаминазите (APOBEC и ADAR), способни да редактират вирусни геноми или транскрипти, както в Hepatitis δ, човешки имунодефицитен вирус (HIV) (Harris et al. 2003; Mangeat et al. 2003; Zhang et al. 2003), хепатит В (Suspene et al. 2005) или дори в ДНК вируси като папиломен вирус (Vartanian et al. 2008). Тези дейности също могат да бъдат източник на генетични вариации при някои РНК вируси. 2.1.3.

Рекомбинация и пренареждане на гени.

Структура на популацията - квазивидове

Високите нива на грешки на РНК вирусите, краткото им време за геномна репликация и високите размери на популацията, заедно с действието на естествения подбор, конфигурират екстремна дарвиновска система, при която скоростта, с която се генерират нови варианти, надвишава скоростта, с която те са фиксиран (Manrubia et al. 2005). Тази динамика на бърза селекция-мутация в РНК вируси непременно води до съжителство на множество варианти в популация, която представлява набор от индивиди, тясно свързани помежду си, но не идентични (Фигура 1). Към тази структура 17

Значението на спектъра на мутантите

Значението на спектъра на мутантите наскоро беше подчертано с две паралелни проучвания, проведени с мутант на полиомиелитния вирус (PV) (Pfeiffer and Kirkegaard 2003; Arnold et al. 2005), които показаха увеличаване на верността, без да се компрометира неговата репликация капацитет. Този мутант генерира квазивид с по-малко разнообразие от дивия тип вирус. При заразените податливи мишки намаляването на вирусното разнообразие доведе до загуба на невротропизъм и по този начин до атенюиран фенотип (Pfeiffer and Kirkegaard 2005; Vignuzzi et al. 2006). Разширяването на разнообразието от квазивидове чрез химическа мутагенеза възстанови невротропизма и патогенезата. Тези резултати установяват пряка връзка между скоростта на мутация, сложността на спектъра на мутантите и вирусната патогенеза in vivo. 2.1.6.

Филогения като инструмент за изучаване на структурата на квазивидовете.

Биологична ефикасност на вирус: фитнес

Биологичната ефективност или годност на вирусен вариант е очакваният принос на този вариант към потомството на следващото поколение в дадена среда (Maynard Smith 1998). Две

Процеси на вариация в биологичната ефикасност

Вирус 1/Вирус 2

102 101 100 10-1

y = 0,318 e0,917x R2 = 0,9218

Фигура 3: Типична схема на вирусно състезание за определяне на относителна годност. Графиката представя съотношението на два вирусни варианта в първоначален инокулум (пасаж 0) и в края на цитолитична инфекция (над 4 пасажа). Всяка точка представлява резултат от инфекция, направена от вирусния препарат на предишната инфекция. Наклонът на графиката представлява временна вариация в пропорцията на всеки генотип. Като се има предвид, че нарастването на x (брой преминавания) е 1 във всяка точка, наклонът в този случай е e0.917 = 2.6 = относителна стойност на фитнес.

Фитнес в детайли

важно, което може да промени резултата от състезание в клетки, които са коинфекцирани от различни вирусни варианти (Baulcombe 1996; Bull and Molineux 1992; Chao 1997; Chao and Tran 1997; Gonzalez-Lopez et al. 2004; Grande-Perez et al . 2005b; Holland 1990; Novella et al. 2004; Russel 1992; Sachs and Bull 2005; Turner and Chao 1998; Turner and Chao 1999; Wilke et al. 2004b; Perales et al. 2007; Valcarcel and Ortin 1989; Holland et al (1989 г.), фитнес изпитанията могат да доведат до много различни резултати в зависимост от степента на коинфекция, която е разрешена в експеримента. 2.2.3.

Еволюция на вирусните фитнес стратегии: зависим от плътността подбор