W УНИВЕРСИТЕТ В БУЕНОС ЕЙРС ФАКУЛТЕТ ПО ТОЧНИ И ПРИРОДНИ НАУКИ 110 n от едно от фиксирането на oogglementqinmigganancia или immunocmmatogggia g изследване на вируса отидете на re Mario Mama]. Резюме на тезата на Закин 1963 година
UNIVERSIDAD DE-BUBNOS AIRES ФАКУЛТЕТ ПО ТОЧНИ И ПРИРОДНИ НАУКИ Приложение dg gg t6c3 gaa de tljggión do cggnlcnonto 1nnnnorluo ggggggcig и имунохронатосггия към изследването на вируса до ла отпадъците grcigg
Спонсор на дипломната работа: д-р Освалдо А. Песо
насочете ÉES Y METONS le le 1) mguoreecemil e) Antigenoedricee Органи на заразените животни в природата]. и експериментално чума по свинете. A Уроците, използвани в le prinre. част от опита идва от заразено експериментално енимеле и чумното кино за мир. ако към енилелеята, отнасяща се до еоепехоевия крак, тези последни органи са били емиедое от различна държава. точки За втората поредица от учения и инфекции бяха прасета от 25 и 30 кг с 2 1. iqyeotedos eubeutáneemente. на 17 суспензия на свински чума вирус LM13, използван: като материал за изтегляне в Laboratoriosmi. Enimlee беше жертвано между третия и осмия ден след заразяването и бе събрана целувка. ганглий и бъбрек. б) серуми и глобалина А - серум от хипериннма на чума по свинете. получени чрез инокулация на вирулентен дефибрин при свине, които вече са имали определен предишен имунитет. aea чрез ваксинация, .виж по болест. Серумът е предоставен на Fuerte Sancti Spiritu Laboratories. // 9
B - Suoro do antiporoino заек, получен чрез последователно инокулиране. с начо или рамо, с дози нормален свински серум. Дневните дози варират от 0,1 до 0,2 1, а броят на инокулациите е 16, прилагани за период от година и половина. При първото инокулиране се използват маслините на Freund в съотношение 2 към 1 според адюванта. Титрите, получени чрез модифициране на токсичността на проепитин, варират между 1/12800 и цялата четна. всяко животно беше следното: Inoo. nl m1 N 'нат. Freund vi t1 m90 прави инокулация 1-ви. 1-ви. 2 ac x) 2 0 1 '1P (x) 1 банан след 3 0. 1 o 1n (m) 2 an 4 O. 1 - o 2 nn 5 0.1-1p 3 nn 6 Q. 1 - m 2 nn 7 0.1 oo 2 a 8 0.15-1p 3 a 9 0. 15-13 2 nn 10 Oo15 - o 2 a 11 0.15 или 1p 3 nn 12 0.15-1! 2 n n 13 0,15 o o 2 n n 14 Oo2-1p 3 n n 15 0,2 c 1m 2 n n 16 0. 2 o e 2 u n (x) ao - euboutánnu (zz) 1p a intraporitonoal (xxx) 1. - intranusoulor llo
при стайна температура и след това се концентрира, два слоя от утайката. 11. - пречистване чрез преминаване през DEAЕцелулозна колона. според техническия ds Courtsin (28). DEAEцелулозата, след като се измие и доведе до рН 6, се суспендира в 0,02 М буфер, рН 6 (фосфатен буфер). докато конюгираното вещество. за пречистване. той беше диализиран за една нощ срещу 1 същия ауспух. Пречистената фракция от интерес. Той се разрежда с 0,02 MpH 6 буфер, докато примесите се елиминират от колоната с pH 5,2 буфер, описан по-рано. Течността се концентрира до първоначалния обем чрез диализа срещу Carbowax 20 M. I - Нормален свински серум. получени от леохони от стада, свободни от чума по свинете. и неваксинирани. o) Разтвори и реактиви A- CIN.oososaoso сода-cos фосфат физиологичен разтвор. 801 8 P0HI. 0 0,00,0. - 2048 4 2 2 Дестилирана вода esp. PH 7-8 "811 B - буфер карбонатобиокарбон до 1000 ml oooooooooooooooooo ÜO3HNh 0.000.000.00000000 Agus дестилирана капачка. 400 m1 PH 9 G // 17
в - Буфер за диализа на конюгирания протеин cocoootneoe100.00.00.000032 g eeeoeeeeeeeeeeo 7.2g Aguad'atilad. качулка. o.u40 0,1 PH 7 D - веронален буфер за вероналсодиева електрофореза. 7,33 g натриев ацетат. 01H0.1N. 4,86 g 45ll Дестилирана вода osp. 750m1 ph 8.6 E o Реагенти, използвани в модифицираното методооолорно трио на Кох и Малбекин (1924): - Разтвор за смилане: 5% разтворът на меден сулфат се смесва със 100 ml концентрирана и чиста сярна киселина. Полученият разтвор се излива внимателно в 100 ml дестилирана вода. Контролен разтвор на амониев сулфат: 9.4332 g чист моника сулфат и сео се разтварят през 3043! 0,2 N за завършване на 1000 m1. Разтворът 80 32 0,2 N се получава чрез разтваряне на 5,6 1 концентрирана киселина във вода до получаване на 1000 ml. Този концентриран разтвор съдържа 2 ul R на nl и е необходимо да се разрежда, за да се използва като контрола.Вода в 20 nl (40 mg N) концентриран разтвор на амониев сулфат. Добавят се 180 nl SO4H20.2N и се допълва до един литър с дестилирана вода. Всеки ml от този разтвор съответства на 0,04 Ig от I. // 18
- Реактив на Нийлер: 22,5 g йод се разтварят в 20 nl ана, съдържащи 30-5 IK. След като разтварянето завърши, бяха добавени 30 g Hgmetallic и това беше добре направено, като се избягва смесването му горещо, охлаждане в задния ток. Разбъркването продължи, докато цветът на самия йод изчезне. Супернатантната течност се декантира и реакцията се тества срещу разтвор на нишесте. Когато реакцията е отрицателна. реагентът е излязъл живак. затова той добави няколко капки йод със същата предишна концентрация. Добавя се йод до леко положителна реакция срещу нишестето. Разтворът се разрежда с вода до пълни обеми на OHNeal lofil Buffere използва 200 ml и след това се смесва с два в колонна хроматография или фосфатен буфер 0,2 MpH 6,3: 387 ml 0,2MPOHN 4 2 (A) се стопява с 112,5 ml от 0,2 до 204 HN32 (В); По този начин имахме 0,2 М фосфатен буфер с рН 6,3. От яде. Разтворът отнема 100 ul и се добавят 1040 ml дестилирана вода. фосфатният буфер 0,0175 MpH 6.3. - Фосфатен буфер 0,02 MpH 6: ако се получи 877 nl (A), те се смесват с 123 ml (B), като се получава фосфатен буфер 0,2 H ph 6. Разреждане на 100 1 и 1000 ll с дестилирана вода и се получава буферът 0t02 l ph 6. // 19
- Буфер ph 5.2 0.00.0000000090000000 g CINE0.0.00.0.0.0.00000000000000 Вода PH 5.2 GBP 00.000.000. Всички материали, с изключение на разтвори. те се държат замразени при -20 с до момента на употреба. Разтворите бяха при 4 ° C. G 2) Eomglement fljgclon a) Вирусни антигени: Същите, използвани при имунофлуорозодент. Всички антигенни материали бяха подложени на следния процес: I - смилане и суспензия 1/5 във vcronal буфер 11- замразяване при -20 ° С за 24 часа. Като минимум. 111- Разрушаване. Центрофугирайте при 3500 об/мин за 15 минути s. IV лечение с 20% хлороформ. разклащане за една минута и центрофугиране за 10 минути при 3500 об/мин за отстраняване на хлороформ. V или Повторение на същата предишна стъпка, ако непрозрачността на материала го налага. VI - Центрофугиране при 15 000 rpn през. 15 минути. 711-миниране на хлорофом шум мл с вакуумна помпа. б) Серум A или Serum hyporinuno do свински чума B - Номинална серумна свиня * // 2-ри
G- Други материали: Комплекс Cobuo, хемолитична система и веронален буфер ph 7. 6. Те са използвани едни и същи в рутинната работа на Секцията по серология на Института по болестта шап, INTA (29, 30, 31). Комплементът е получен чрез вдлъбнатина на 400 g женски мед oobayoe или небременна жена. Споменатото допълнение е озаглавено!) По техниката на 50! на hemolieis, описани от Oeler et al. (16) Адидодиетилбарбитуричен веронален буфер. 9.200s разтворени в 1 литър дестилирана вода 0000.00. oeeooeeoeeoeeeeooo 2 6 eeoeoeeooee-eno.eoeee-eeoeee Dieülbarbiturato d. 00610 eeeeooo 6 g 01113. 167.600g 603m. 5.04g се допълва с 4 литра дестилиран галегас и се филтрира. Etl се етерифицира. в продължение на 20 минути. g 3) Immungoorogtoggg ph 7.66 (за една 1/5 употреба) e) Antigenoe viriooe: Същият, използван в двата споменати по-рано reeooions. Приготвянето на антигените е подобно на това на антигените за фиксиране на комплемента, с изключение на // 21
в стъпка I, при която суспензиите не са направени с фосфатен физиологичен разтвор ph7.8 - O. или вместо с веронален буфер, ph 7. 6. b) Серуми: A Hyperimne серум от чума по свинете B - Sunro нормално свинско с 012199 материали: Фосфатен физиологичен разтвор. ph7.8 или 8. чиято формула е изброена по-горе. Методи 1) Imnofluoreacencig Technique Atom Prggoion; Искам да се плъзгам 59 направиха отпечатъци върху органа на antalbrmontelavubs с фокфатиран физиологичен разтвор. Мазките бяха фиксирани за 20 минути; при -20 c oo ацетон. Те бяха измити с бидостилирана вода, извадени и не съхранявани при 4 С. Използваният метод беше непряк. Първо, върху намазката, вече фиксирана, се отлагат капки немаркиран хипоринонов серум. Оставя се в студена камера за 30 MmtogaJBQWngdn в продължение на 10 минути, оставя се да изсъхне и се обработва отново, отново във влажна камера с маркираното вещество. В този етап инкубацията е 50 минути при 37 С. Измива се плъзгач с бидеатилиран ага, оставя се да изсъхне и затваря 6.6 до наблюдение на микросопион при температура 40. // 22
Контроли Направени са контроли или нормални серуми. Използван е микроскоп Leltz fltzlor от типа Ortholux, който има като източник на светлина a; лампа 1/4 3 t Ï. 4 a - + 17; - C. 1 4 '18 + 1/52 4 + naad no - - gai 111 9 C dm - x 21.22 a. -. Í -. + 23 * + 1 a '24 25 «I-1/32 + t * - I- - '+ 26 + 1/5 '- E 27 +> 1/40 4 á + 28 + 1/30 É td + 29 + 1/33 -; 3o' F 1/24 + ag 31 + 1/30 i + e + + 32 1/40 + E - r + 33037039 34.35.40 -0 до '+ .- = + -. + L.5 5' + -, _ + 4 + 38 1/18 1/38 "1/5 1/40-3 í - - '. + - + 41 + 1/60: í + a General Alvnr + 1/25 I + g + Fc a Фиксация на комплемента IF s Imnofluoruccnce IC s Immochronatomfh I pigs z Инокулация при прасета DDIH'I + 00. - положителен местен мамут. положително съмнително антиконплеменуна Когато в още един ред сложи моите материали. това означава
инокулацията при прасета е фиксиране на комплемента (50% хембиза). Съвпадението между двата тоника е 74,3%. По отношение на техниката на инфлунореосееноята. Става очевидно, че неговата чувствителност е все още много по-ниска от тази на фиксирането на комплемента и сравняването на стойностите между метода на инокулация и този на имунофлуоресоеноята. съвпадението е 43%, като се вземат предвид данните, посочени като Е в съмнителната категория, а не положителни или отрицателни. По отношение на техниката на innunoeronatograria, може да се види, че в момента тя е тази с по-малка чувствителност. Сравнения между резултатите, получени по четирите метода. и процентите на съвпадението. те се намират в таблици III, IV и V. dro eo CU DE II активен сред четирите използвани teonioas Положителен Положителен fi Положителен fi Положителен f при свине в FC Coino. в IF Caine в IC Coino. 35], 26 74.3 15 43 11 31.5 GUÉDHD IV Таблица за сравнение между нинокулация при прасета и фиксиране на комплемента Положително в ушите Положително при фиксиране на комплемента 5 (50%) 35 26 li '74 .3 4 // 38
20 теста за разумна мечка, използващи силно заразни материали от животни, заразени с високи дози вирулентен убиец Откриване на антиген в заразени експериментални животни 1, жертвани по различно време след заразяване, Както е обяснено в материалите за готвене, в параграф Б от антиген, използван при имунофлуоресценция. Без свински чума и неваксинирани животни се инокулират с вирус и се жертват на третото. четвърти пети. шести. седми и осми ден след инокулацията. Събрани са далак. мезентериални ганглии и бъбреци на споменатите животни и е направен опит да се докаже наличието на антиген чрез фиксиране на комплемента и имунофлуоресценция. Данните за животните в опит. Ани като клиничните нарушения, които са претърпели, са намерени в таблица VI. Клинична таблица VI на животните по време на клане Клинични заболявания при животни Време на N клане след инфекция 181 няма 3 дни 132 няма 4 дни 183 няма 5 дни 184 темп. 41,5 0 6 дни 185 13011 113-410500 7 кажи му 166 темп. 42 C, общо разпадане 8 dins 187 няма 3 дни 188 няма 4 дни 189 няма 5 дни 190 temp. 41 С 6 дни 191 темп. 42 C 7 дни 192 i temp. 42,5 ° С, общ деаимион 8 дни