Центрофугирането е техника на утаяване, ускорена благодарение на използването на центробежна сила. Прилага се за анализ или разделяне на смеси от частици, клетки, органели или молекули.

коефициента утаяване

Теория на центрофугирането и количествени аспекти: виж Luque, стр.123 или Freifelder, стр.298.

Инструментална

1. Тръби

Изработени от стъкло или пластмаса. Химически устойчив (разтворители, реактиви) и физически (опън при използваните високи скорости). Различни размери и форми. Специални пластмаси за високи скорости.

2. Центрофуги

Можете да регулирате скоростта, времето, температурата. Високи скорости (10 2 -10 5 об/мин).

3. Ротори

Два вида: ъглов или фиксиран ъглов ротор люлеещ се ротор

Условия

Според скоростта:

Приблизителен критерий:
Нискоскоростно центрофугиране по-малко от 10 000 оборота в минута
Високоскоростно центрофугиране между 10 000 и 20 000 оборота в минута
Ултрацентрифугиране повече от 20 000 оборота в минута

Според целта:

1. Аналитично центрофугиране

Целете се: измерва физическите свойства на частиците, които се утаяват, като коефициента им на утаяване или молекулната им маса. Особено във варианта ултрацентрифугиране аналитика.

Молекулите се наблюдават чрез оптична система по време на центрофугиране. Епруветките за центрофугиране трябва да бъдат кварцови, за да могат да преминават видима и ултравиолетова светлина. Накланящ се ротор, вертикално наблюдение.

2. Подготвително центрофугиране

Най-често използвани. Целете се: изолира частици, клетки или молекули за анализ или по-късна употреба. Като цяло се използва по-голямо количество проба, отколкото в аналитиката.

В зависимост от средата, в която се центрофугира и начина на нанасяне на пробата:

1. Диференциално центрофугиране

(Нарича се още мобилна граница). Епруветката се пълни с проба и се центрофугира. Поведението на всеки компонент на пробата зависи от неговата форма, размер, плътност и, логично, за условията на центрофугиране. Получават се само 2 фракции: утайка и супернатант.

[Забележка: думата утайка е по-подходяща за нещо неразтворимо, което се утаява чрез центрофугиране или по други механизми (например химическа реакция); утайка по-правилно е за това, което е било принудено да стигне до дъното, но все пак би било разтворимо; pellet е английска дума за това, което се уплътнява на дъното в резултат на центрофугиране]

A ап типично е субклетъчно фракциониране (разделяне на различните компоненти на клетката, главно органелите) (вж. Luque или Alberts) с помощта на последователни центрофугирания с нарастваща скорост.

2. Центрофугиране със зонална или скорост на утаяване

Пробата се нанася на тънък слой върху центрофугиращата среда, която е градиент на плътността. При центробежна сила частиците се утаяват през градиента, концентрирайки се в отделни зони или ленти. Вашата скорост напред (и следователно механизмът за разделяне) зависи от неговия размер, форма и плътност; всички тези параметри се комбинират в коефициента на утаяване,

`" Коефициент на утаяване "= s = (" скорост на утаяване ")/(" центробежно ускорение ")`

което се измерва в svedberg единици (1 С = 10 −13 секунди).

Центрофугирането трябва да приключи преди някоя от отделените частици да достигне дъното на тръбата. Отделните компоненти се събират поотделно чрез много внимателно аспириране на различните ленти или, по-добре, чрез пробиване на дъното на тръбата и събиране на фракции течността, която пада.

Може да се види анимация на раздялата.

Градиентът на плътността се създава чрез градиент на концентрация: увеличаване на концентрациите, слизане по тръбата, на подходящ компонент. За това се използват захароза, цезиев хлорид, албумин, говежди серум на плода. или търговски среди като Ficoll - синтетичен полизахарид -, Percoll, метризамид.

Можете да подготвите:
още прекъснат градиент или на стъпки, ръчно
б) а непрекъснат градиент, с помощта на устройство за образуване на градиент
в) а самостоятелно оформен непрекъснат градиент, ако е създадена чрез центрофугиране, обикновено едновременно с пробата се фракционира

А) Приготвяне на непрекъснат градиент на плътността с помощта на миксер.

Б) Прилагане на пробата върху градиента.

В) Поставяне на тръбите в накланящ се ротор и центрофугиране.

Г) Събиране във фракции от отделените компоненти.

С тази техника е възможно например да се разделят всички видове кръвни клетки, да се пречистят жизнеспособни сперматозоиди, да се отделят жизнеспособни и нежизнеспособни клетки от дезагрегирани тъкани и проби с клетки в суспензия и т.н.

3. Изопикнично или седиментационно равновесно центрофугиране

Използва се и градиент на плътността, но в този случай времето на центрофугиране е достатъчно дълго (до 1 или 2 дни), така че седиментационен баланс (между центробежната сила, хидростатичната тяга на клетката и нейната дифузия). За да се постигне това, се използват непрекъснати градиенти, които покриват целия диапазон на плътността на компонентите на пробата: в дъното на епруветката плътността на средата трябва да бъде по-голяма от тази на най-плътния компонент. По този начин, независимо от времето на центрофугиране, частиците, клетките и т.н. Те никога няма да се утаят на дъното, а вместо това ще достигнат стабилна междинна позиция на градиента, където са концентрирани в много тясна лента (по-добра разделителна способност). Най-често срещаното е смесването на пробата с материала, който ще формира градиента и ще генерира самообразуващ се градиент едновременно с разделянето. Изисква много високи скорости (ултрацентрифугиране), за да се образува градиентът.

В допълнение към по-високата резолюция, интересното при тази техника е, че тя се разделя изключително според плътността на компонентите на пробата, които се намират в положението на градиента, където плътността на средата е равна на собствената (изопикнична = с еднаква плътност, на гръцки).

Сравнение и допълнителна информация:

Ротор ъглова, обикновено.

Разделяне главно въз основа на размера, но също и на коефициента на утаяване с, което зависи от масата (размер × плътност) и формата. (измерено в Svedbergs, 1S = 10 -13 секунди)

Приложение: разделяне на клетъчни типове, субклетъчно фракциониране (отделяне на органели), отделяне на макромолекулни асоциации и др.

Ротор люлка.

Разделяне като функция от коефициента на утаяване с, което зависи от масата и формата. Градиентът предотвратява конвективно/дифузионно смесване: добре разделени ленти. Центрофугирането се спира, преди да се достигне равновесие. Максимална плътност на градиента на плътността на компонентите на пробата.

Приложение: разделяне на молекули нуклеинови киселини, пречистване на нуклеинови киселини и др.

4. Бариерни методи

Бърз метод, типичен например за получаване на циркулиращи кръвни левкоцити, свободни от останалите кръвни клетки. Това е центрофугиране през среда с постоянна плътност (може да се разглежда като стъпаловиден градиент на един етап). Плътността на това легло трябва да бъде междинна между тази на клетъчните типове, които трябва да се разделят. За това се използват търговски среди като Ficoll-Paque, Lymphoprep и много други, които обикновено са съставени от смеси от Ficoll (синтетичен полизахарид) и метризамид (йодирано синтетично съединение). Предлагат се различни среди с адекватна плътност за разделяне на специфични типове клетки; например Nycoprep 1,077 за мононуклеарни клетки, Nycoprep 1,068 за моноцити, Polymorhoprep за полиморфонуклеарни клетки или Nycoprep 1,063 за тромбоцити.

Изчисления

Преобразуване от скорост на въртене (обороти в минута, об/мин) към центробежно ускорение (относителна центробежна сила, FCR, без единица):

Същото разделяне ще бъде постигнато в 2 различни центрофуги, когато FCR е еднакъв, а не ако скоростта на въртене (об/мин) е еднаква. Поради това е важно условията за центрофугиране да се дават в FCR, а не в обороти в минута. .

FCR е това, което в разговорно се нарича „брой на ges“, тъй като се измерва като се използва ускорението на гравитацията като единица., ж. Така се изразява, например, "центрофугиране от 15 минути при 20 000 g" (или "при 20 000 × g").

Връзката между двете зависи от радиуса на ротора (измерен от оста на въртене до положението на пробата в тръбата), както следва:

Разделянето чрез центрофугиране зависи от клетъчната маса („m“), радиуса на въртене на тръбата - или радиуса на ротора - където се поставя пробата („r“) и скоростта, достигната от центрофугата („омега“) или `n`):

`F_c = m * a = (m * v ^ 2)/r = (m * e ^ 2)/(r * t ^ 2) = (m * phi ^ 2 * r ^ 2)/(r * t ^ 2) = (m * phi ^ 2 * r)/t ^ 2 = m * omega ^ 2 * r = `

`F_c` = центробежна сила
`m` = маса на клетката
`a = v ^ 2/r` = ускорение; за единично гравитационно утаяване, "a = g =" 9,8 m/s 2 = 980 cm/s 2
`v = e/t` = линейна скорост на пробата в епруветката (cm/min)
`r` = радиус на въртене, измерен между средната точка на тръбата на центрофугата и оста на въртене (cm)
`e` = линейно изминато пространство, ако движението е линейно (cm)
`t` = време за утаяване, използвано при центрофугиране (мин)
`phi` = ъгъл, изминат при движението на въртенето (радиани = ъгъл, чиято дъга е равна на` r`); `phi = e/r`
`omega = phi/t` = ъглова скорост, тъй като движението е ротационно (rad/min = min -1)
`n` = скорост на въртене (обороти в секунда = rps или обороти в минута = rpm); `омега = 2pi \ n`

Изчисляване на относителната центробежна сила:

`FCR = F_c/(F_g) = a/(g) = (39,48 * m * n ^ 2 * r)/(m * 980 (cm)/s ^ 2) = 0,0403 * n ^ 2 * r \ \ cm ^ -1 * s ^ 2`

Ако отделим обичайните единици (скорост в обороти в минута и радиус в см):

Което обикновено се пише като `FCR = 11,19 * 10 ^ -6 * n ^ 2 * r` или` FCR = (n ^ 2 * r)/89365`
което приема, че "n" е в обороти в минута, а "r" е в cm

Като пример, нека разгледаме решено упражнение:

Броят на „g“, постигнат в ротор на центрофуга с радиус 5 cm, въртящ се със скорост 10 000 об/мин, е:
`FCR = (10000) ^ 2 * 5/89365 = 5600xxg`

Удобно е да знаете как да се справите с това преобразуване.

Изчисляване на FCR от обороти в минута и обратно, за различни радиуси на въртене на ротора.