| В В | В |
Персонализирани услуги
Списание
- SciELO Analytics
- Google Scholar H5M5 ()
Член
- Испански (pdf)
- Статия в XML
- Препратки към статии
Как да цитирам тази статия - SciELO Analytics
- Автоматичен превод
- Изпратете статия по имейл
Индикатори
- Цитирано от SciELO
Свързани връзки
- Подобно в SciELO
Дял
Вестник за ветеринарни изследвания на Перу
версия В отпечатана ISSN 1609-9117
Rev. investiga. ветеринар. Перу v.23В n.3В ЛимаВ АвгустВ 2012
Използване на полимеразна верижна реакция за полов контакт с южноамерикански камили
Ваня Черна гора В. 1, Ленин Матурано Х. 1,2,3, Джейн С. Уилър 2, РаГел Росадио А. 1,2
Целта на това проучване е да се разработи PCR техника за определяне на пола на южноамериканските камили (CSA), като се използват последователности на цинков пръстен протеин (ZF) от проби от кръв и фекалии, както и клетки от ембриони от алпака. Използвани са общо 28 проби от кръв от алпака, лама и викуана, 20 фекални проби от викуа и гуанако и 22 ембриони от алпака, събрани между 72 и 96 часа следкопула. Пробите от фекалии и ембриони са запазени съответно в 96% и 70% етанол. ДНК беше извлечена от кръв и изпражнения с помощта на търговски комплекти. Използвани са три метода (кипене, протеиназа К и фенол-хлороформ) за извличане на ДНК от ембриони на алпака. Бяха разработени две PCR техники за анализ на ДНК: мултиплекс (за ДНК на фекални и кръвни проби) и хеминиран PCR (за ДНК на ембрионални клетки). Мултиплексната PCR точно определя пола в 100% от ДНК пробите, извлечени от кръв, в 87,5% от пробите, извлечени от пресни изпражнения и в 50% от 4-годишните фекални проби. Хеминираната PCR обаче не може да бъде оптимизирана.
Ключови думи: ДНК, PCR, секс, южноамерикански камили
ВЪВЕДЕНИЕ
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Получаване на ДНК проби
ДНК екстракция от кръв
ДНК екстракция от изпражнения
ДНК екстракция от ембриони
Количествено определяне на ДНК
Концентрацията и степента на чистота на ДНК, извлечена от всички проби, бяха определени чрез спектрофотометрия при 260 nm и 280 nm. Качеството на ДНК се проверява чрез електрофореза върху агарозен гел.
Процесът на оптимизация в кръвната ДНК се състои в амплифициране на сегменти с различни размери на силно консервирания ZF ген при бозайници, като се използват три праймера (Aasen и Medrano, 1990). Протоколите използваха праймерите ZFX2 и ZFX4 за усилване на сегмент от 250 базови двойки (bp), присъстващ на двата полови хромозоми (ZFX и ZFY), и трети обратен ZFY2, използван заедно с праймера ZFX2 за усилване на сегмент от 130 bp, присъстващ само върху Y хромозомата (ZFY) (Черна гора и др., 2007).
Разделителна способност на разширени фрагменти
Продуктите от всяка PCR се анализират на 2% агарозен гел в 0,5X TBE буферен разтвор (Tris, борна киселина, EDTA), в хоризонтална камера за електрофореза заедно с маркер за молекулно тегло, за да се определи размерът. Приблизително на амплифицираните фрагменти . Продуктите за PCR бяха оцветени с етидиев бромид, визуализирани на трансилуминатор и заснети с камера Polaroid (DS 34).
Тълкуване на резултатите
Животни, чиито проби показват само амплификацията на 250 bp PCR продукт (ZFX-Y), са диагностицирани като женски, а тези, които показват два едновременни ампликона, един от 250 bp (ZFX-Y) и друг от 130 bp (ZFY), са диагностицирани като мъже.
РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ
ДНК, извлечена от кръвта на алпаки и лами, имаше висока концентрация (45-201 ng/μL) и добра степен на чистота (> 1,8 и минимално наличие на разграждане), потвърждавайки подобни характеристики, съобщени за други видове (Chu et al., 2006). Кръвната ДНК на дивите животни също е с висока концентрация (39-211 ng/μL) и добра чистота (> 1,8) (Таблица 4).
Успешното усилване на отделните ZFX и ZFY сегменти в единична PCR, както и съвместното откриване на ZFX и ZFY сегменти в множество PCR са подробно описани в Таблица 5. Оптимално усилване на ZFY е постигнато при използване на температура на подравняване 52 ° C и концентрации на Mg от 1,6 mM и говежди серумен албумин (BSA) от 1,2 μg/μL, което позволява да се усили добър продукт в проби, съдържащи до 25 ng ДНК. За оптимално усилване на ZFX-Y сегмента се изисква температура от 64 ° C с концентрации на Mg от 2,7 mM и BSA от 0,8 μg/μL, необходими за получаване на видими продукти в проби с повече от 0,1 ng ДНК.
Условията, оценени за оптимизиране на множествената PCR, определят, че за оптично усилване на двата сегмента е необходимо да се използват следните условия: 53 ° C температура на подравняване, 2,5 mM Cl2Mg, 1% BSA, 1% формамид, 50 pmol праймер ZFX2, 12,5 pmol на ZFX4 и 25 pmol на ZFY2 (Таблица 5). При тези условия беше възможно да се получат добри продукти в концентрации на ДНК до 20 ng.
ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА
1. Aasen E, Medrano JF. 1990. Амплификация на гените ZFY и ZFX за идентифициране на пола при хора, говеда, овце и кози. Биотехнология 8: 1279-1281.
3. Chu J, Lin Y, Wu H. 2006. Приложимост на неинвазивно вземане на проби при популационно генетично изследване на тайвански макаки (Macaca cyclopis). Тайвания 51: 258-265.
4. Deuter RS, Pietsch, Hertel S, Müller O. 1995. Метод за получаване на подходяща PCR на фекална ДНК. Нуклеинови киселини Res 23: 3800-3801.
5. Garcгa-Muro E, Aznar MP, Rodellar C, Zaragoza P. 1996. Специфични за пола PCR/RFLPs в кучешките локуси ZFY/ZFX. Anim Genet 28: 150-158.
7. Lemos DC, Lopes Ríos AF, Caetano LC, Lobo RB, Vila RA, Martelli L, Takeuchi PL, Ramos ES. 2005. Използване на гена TSPY за пол на говеда. Genet Mol Biol 28: 117-119.
9. Novoa C, Franco E, García W, Pezo D. 1999. Доза на гонадотропин (eCG и hCG), суперовулация и получаване на ембриони в алпаки. Rev Inv Vet, Перу 10 (1): 48-53.
10. Nsubuga AM, Robbins MM, Roeder AD, Morin PA, Boesch SC, Vigilant L. 2004. Фактори, влияещи върху количеството геномна ДНК, извлечена от маймунските фекалии и идентифицирането на вентилатора, подобрен опростен метод за съхранение. Mol Ecol 13: 2089-2094.
11. Ortega J, Franco M, Adams BA, Ralls K, Maldonado JE. 2004. Надежден неинвазивен метод за определяне на пола в застрашената лисица от San Joaquin (Vulpes macrotes mutica) и други каниди. Conserv Genet 5: 715-718.
12. Phua A, Abdullah R, Mohamed Z. 2003. Метод за определяне на пола, основан на PCR, за евентуално прилагане при подбор на пол от кози чрез едновременно усилване на гените Sry и Aml-X. J Reprod Dev 49: 307-311.
13. Prithiviraj F, Melnick J. 2001. Молекулярен полов бозайник от еутерия. Mol Ecol Бележки 1: 350-353.
14. Pilgrim KL, Mckeelvey KS, Riddle AE, Schwartz MK. 2005. Felid идентификация на пола въз основа на неинвазивни генетични проби. Mol Ecol Бележки 5: 60-61.
15. Pomp D, Good BA, Geiser RD, Corbin CJ, Conley AJ. 1995. Идентификация на пола при бозайници с полимеразна верижна реакция и използването му за изследване на сексуалните ефекти върху диаметъра на ден 10 или 11 свински ембриони. J Anim Sci 73: 1408-1415.
16. Thibier M, Nimbart M. 1995. Половината на говежди ембриони в полето. Териогенология 43: 71-80.
17. Vidya TNC, Roshan V, Aravazhagan C, Sukumar R. 2003. Прилагане на молекулярния пол за свободно отглеждани популации на азиатски слонове (Elephas maximus) в Южна Индия. Curr Sci India 85: 1074-1077.
18. Villesen P, Fredsted T. 2006. Бърз и неинвазивен PCR пол на примати: маймуни, маймуни от стария свят, маймуни от нов свят и Strepsirrhines. BMC Ecology 6: 8. [Интернет]. Достъпно на: http://www.biomedcentral.com/1472-6785/6/8
19. Wasser SK, Houston CS, Koehler GM, Cadd GG, Fain R. 1997. Техники за прилагане на полеви изследвания на фекална ДНК на Ursids. Mol Ecol 6: 1091-1097.
Факултет по ветеринарна медицина
Av. Circunvalacián Cdra. 28 с/н - Сан Борха
Каре 03-5137 - Лима - Перу
Тел .: (511) 435-3348 разширение 236
Факс: (511) 6197000 разширение 5017