Използван е полеви щам на Mycobacterium avium paratuberculosis, дарен от д-р Марко Антонио Сантилан от CENID INIFAP Microbiology, този щам е използван като положителна контрола в PCR анализа.

В края на 2008 г. бяха събрани 139 проби от кръв и кръв от кози на възраст между 1 и 3,5 години в общността La Mesilla, в община Tecozautla. Тази община се намира в щата Хидалго, между паралели 20 ° 48 'ширина, -99 ° 67' дължина, на надморска височина от 1890 метра. В тази област има производители от селски тип с производства с ниско ниво на техника с малко превантивни медицински практики, а производството на кози е широко. Работили са с 8 различни стада, всички заподозрени в Карта. Фекалиите се поставят в торбички, а кръвните проби във вакуумни епруветки без антикоагулант. След събирането на пробите се поставят в термос с лед за тяхното консервиране и последващ анализ в лабораторията по селскостопанска микробиология на Университетския автоном Metropolitana Xochimilco Unit.

Петно на Ziehl-Neelsen (ZN)

Всички проби на изпражненията бяха анализирани с помощта на специално петно, устойчиво на киселина и алкохол (17), което основно разкрива наличието на киселини, устойчиви на киселина и алкохол, съвместими с Map.

Извличане на ДНК от проби от изпражнения

Вложен PCR за откриване на карта

За първото усилване бяха използвани външните грундове IS 900-F (5 'TGATCTGGA CAATGACGGTTACGGA 3') и IS 900-R (5 'CGCGGCACGGCTCTTGTT 3'), които усилват продукт от 563 bp (18). PCR реакцията съдържа: 45 µl PCR смес (22mM Tris-HCl pH 8.4, 1.65 mM MgCl 2, 220 uM dGTP, 220 dATP, 220 uM dCTP, 220uM dTTP, 2 U Taq полимераза (Promega) 300 pM от първата IS900-F, 300 рМ от първия IS900-R и 2 µl ДНК проба. Условията на PCR циклите бяха: първоначална денатурация от 94 ° C за 3 минути, след което да продължи с 35 цикъла от 94 ° C за 1 минута, 56 ° C за 1 минута и 72 ° C за 1 минута. За второто усилване (вложена PCR) бяха взети 5 µl от амплифицирания продукт и добавени към нова PCR реакция, вече с вътрешни праймери IS 900 -IF (5 'GCCGCGCTGCTGGAGTTGA 3') и IS 900-IR (5 'AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG 3'), които генерират продукт от 210 bp, условията на този PCR цикъл са еднакви. Продуктите, получени от това второ усилване, се визуализират чрез електрофореза върху 1% агароза гелове, оцветени в етидиев бромид (18).

Използвани са само серуми от животни, принадлежащи към стадото с положителни усилвания за Map. За извършване на техниката беше използвана търговска система «Паратуберкулозен скрининг Ab kit» (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) (19), следвайки спецификациите на производителя.

Извличане на ДНК от проби от изпражнения

Процедурата за екстракция и визуализация на ДНК е извършена върху 139 проби. От тези проби само 54 са имали ясно присъствие на ДНК. На (Фигура 1) се наблюдава ДНК, извлечена от някои проби, както може да се види на тази фигура, получената ДНК показва леко разграждане, което не е повлияло развитието на PCR техниката, също е било възможно да се оцени в някои проби наличието на РНК, което е нормално предвид използвания протокол за екстракция.

avium

Петно на Ziehl-Neelsen (ZN)

При анализа на пробите чрез ZN оцветяване, 6 от 139 анализирани проби са положителни за оцветяване, т.е. устойчиви на киселина и алкохол бацили, съвместими с Map (Фигура 2, Таблица 1). За стадо А 4-те положителни проби представляват 20%, докато за стадо D са наблюдавани 4% от пробите, положителни за оцветяване, и накрая в стадо Н е получена положителна проба за оцветяване, което представлява 8,3% от общото стадо.

Преди използването му с пробите, PCR техниката беше стандартизирана, като се използва ДНК от щам Map. Тази ДНК се използва във всички анализи като положителна контрола. От всички анализирани проби, 7 са имали положителни резултати при вложен PCR (Фигура 3). Трябва да се отбележи, че тези 7 проби са от стадо А, съвпадащи с три положителни проби за ZN оцветяване и пет за ELISA (Таблица 1). Тези седем проби представляват 5,03% от общите проби; и 35% от общите проби от стадо 1, където има по-висока честота на проби, положителни за Map .

Анализ на серуми чрез ELISA

Чрез PCR и ZN оцветяване са анализирани само серумите от положителните стада на картата, получените резултати са показани в Таблица 2, където са включени отрицателни и положителни референтни стойности. Използвайки тези данни, беше установена гранична точка от 0,438, както беше предложено от Kurstak (20). Като се има предвид тази стойност, пробите A3, A18, A8, A11 и A16 са положителни. В случая на проби A11 и A18 резултатите съвпадат с тези, получени при PCR теста.

Паратуберкулозата е инфекциозно заболяване с разпространение в световен мащаб, което се отразява негативно на добитъка. В Мексико ситуацията по отношение на честотата на това заболяване е неизвестна и има малко съобщения за дребни преживни животни. В тази работа се съобщава за присъствието на Map в стадо кози в Tecozautla, Hidalgo, което е първият доклад на Map в тази област. Преди това Чавес и др. (8) проведоха търсене на този микроорганизъм, използвайки различни методологии в козе стадо, разположено в Мексиканската долина. Тази работа, заедно с предишната, представлява първите доклади на Карта при козите.

Различни методологии са създадени за определяне на присъствието на инфекциозен агент в популация, логично първата е изолирането; обаче за много патогенни микроорганизми, особено тези от рода Mycobacterium spp., изолирането е трудно и представлява риск, тъй като някои видове от този род се считат за зоонозни (10,18). В тази работа бяха използвани директни и индиректни методи; в първия случай беше решено да се използва молекулярен метод, базиран на PCR техниката, който разкрива присъствието на ДНК в клинични проби. Този метод има и предимството, че като не работи директно с агента, това е безопасен метод. По тази методология бяха идентифицирани седем положителни проби от общо 139. Положителните проби бяха от животни, принадлежащи към същото стадо, където бяха изследвани 20 проби. Чавес и др. (8) работейки с едно стадо от 27 животни, те са постигнали изолация в 4 случая и са отнели приблизително 14 седмици; в нашия случай идентифицирането на положителни животни изискваше само два дни.

Тази работа също така представя нов протокол за екстракция на ДНК от проби на изпражненията.Тази процедура използва гуанидин изотиоцианат и позволява ефективно извличане на нуклеинови киселини. Този метод не е бил използван преди, тъй като в няколко от проучванията, при които изпражненията се използват като проби, се използват търговски системи, които увеличават цената на анализа (21,22); в този случай обаче разработеният метод има ниска цена.

Прякото наблюдение в клинични проби на микроорганизми от рода Mycobacterium (микроскопия на цитонамазка) е друг метод за идентификация, който се възползва от способността на тези бактерии да задържат основното петно, дори след обезцветяване с киселинен алкохол, ситуация, при която само киселинно-алкохолни организми резистентен (AAR) може да покаже, изключвайки други бактериални родове, присъстващи в изпражненията, като отрицателни или положителни бацили. Zimmer et al. (23) съобщават през 1999 г., че тестът за оцветяване на Ziehl-Neelsen има чувствителност от 49,3% при животни с клинични признаци и 19,3% при субклинични животни. На този етап трябва да се изясни, че същият този тест в хистологични секции е послужил за установяване на окончателно връзката на Mycobacterium spp. с развитието на грануломатозни лезии в червата.

От друга страна, Tripathi et al. (16) работещи с проби от кози черва успяха да установят 80% корелация в проби от червата с лезии и хистология, предполагащи амплификация на Map и IS900 в PCR теста. В тази работа присъствието на AAR бацили е показано в 6 проби от изпражнения, като се имат предвид предишните данни, може да се каже, че тези животни са положителни към Map. По подобен начин на други изследвания резултатите, получени в микроскопията на цитонамазка, корелират с резултатите, получени в PCR.

Whittington et al. (24) съобщиха, че Mycobacterium avium paratuberculosis не може да бъде открита чрез изолационни техники при животни на възраст под две години, които са заразени с бактериите, тъй като те елиминират минималните нива на Mycobacterium avium paratuberculosis. В тази връзка в настоящата работа са получени седем положителни проби от Mycobacterium чрез PCR техника в проби от животни на възраст под три години, установяващи, че тази техника може да се използва при млади животни за диагностициране на паратуберкулоза.

И накрая, по отношение на данните, получени в ELISA, само положителното стадо е анализирано чрез PCR; в това стадо честотата на паратуберкулоза е била 25%. Има обаче животни, които са много близо до граничната точка (20), които са отрицателни в тази работа, така че стойността на честотата може да бъде по-висока. В тази връзка, въпреки че ELISA серологичният тест има по-висока чувствителност, важно е да се изясни, че има и различни фактори, които му пречат, като състоянието на животното. Tripathi et al. (16) изследва заразени животни чрез PCR и ELISA и установява, че в някои случаи не е имало наличие на високи титри, някои дори са отрицателни, което съвпада с резултатите, наблюдавани в тази работа.

Наличието на Mycobacterium avium paratuberculosis беше демонстрирано с PCR диагностичен тест, базиран на откриване на последователността на вмъкване на IS900, ZN оцветяване и ELISA, в стадо кози в Tecozautla, Hidalgo. Необходимо е да се извършват повече изследвания в различни райони на Мексико, за да се изключи или потвърди наличието на Карта, тъй като няма достатъчно информация относно Картата при козите.

1. Харис NB, Barletta RG. Mycobacterium avium subsp. паратуберкулоза във ветеринарната медицина. Clin Microbiol Rev. 2001; 14 (3): 489-512.

2. Виларино М.А., Скот Х.М., Йордания ER. Влияние на паритета по време на откриване на серологични антитела към Mycobacterium avium подвид паратуберкулоза върху намаляването на дневната и продължителната продукция на мляко при кравите Холщайн. J Anim Sci.2011; 89: 267-276.

3. Weigand PV, Goethe R. Патогенеза на Mycobacterium avium подвид паратуберкулозни инфекции при преживни животни: все още повече въпроси, отколкото отговори. Microb Infect. 1999; 1 (13): 1121-1127.

4. Carslake D, Grant W, Green Laura E, Cave J, Greaves J, Keeling M, et al. Ендемични болести по говедата: сравнителна епидемиология и управление. Phil Trans R Soc B. 2011; 366: 1975-1986.

5. Fiorentino MA, Gioffré A, Cirone K, Morsella C, Alonso B, Delgado F, et al. Първо изолиране на Mycobacterium avium subsp. паратуберкулоза при млечна коза в Аржентина: Патология и молекулярна характеристика. Small Rum Res.2012; 108 (1-3): 133-136.

6. Maheshwari A, Fakhruddin F, Tanwar RK, Chahar A, Singh AP. Серопреобладаване на паратуберкулоза при кози в Биканер. Ветеринарна практика. 2012; 13 (1): 28-29.

7. Medeiros L, Junior FG, Almeida AP, Lucena EA, Riet-Correa F. Паратуберкулоза при кози и овце в щата Параиба. Бразилски ветеринарни изследвания. 2012; 32 (2): 111-115.

8. Chávez GG, Trigo TF, Svastova P, Pavlik I. Идентифициране на генетичния полиморфизъм на изолатите на Mycobacterium avium paratuberculosis от кози от централно Мексико. Vet Mex. 2004; 35 (1): 72-82.

9. Preziuso S, Magi GE, Renzoni G. Откриване на Mycobacterium avium subsp. паратуберкулоза в чревни и млечни тъкани и в лимфни възли на овце с различни техники и връзката му с чревни лезии. Small Rum Res.2012; 105: 295-299.

10. De Juan LÀJ, Romero B, Bezos J, Castellanos E, Aranaz A, et al. Сравнение на четири различни културни среди за изолиране и растеж на щамове Mycobacterium avium paratuberculosis от тип II и тип I/III, изолирани от говеда и кози. Env Microb. 2006; 72 (9): 5927-5932.

11. Hailat N, Fayyad A, Ababneh M, Hananeh W, Rezig FE, Jaradat S. PCR- рестрикционен ендонуклеазен анализ на Mycobacterium avium subsp. паратуберкулоза изолира от кози, овце и говеда в Йордания. Comp Clin Pathol. 2012; 21 (5): 755-760.

12. Форде T, Kutz S, de Buck J, Warren A, Ruckstuhl K, Pybus M, et al. Поява, диагностика и типизиране на щам на Mycobacterium avium подвид паратуберкулозна инфекция при скалисти планински бигхорн овце (Ovis canadensis canadensis) в югозападна Алберта. J Дивата природа Dis. 2012; 48 (1): 1-11.

13. Díaz FO, Banda VR, Jaramillo LM, Arriaga CD, González DS, Estrada C. Идентификация на говеда, носещи Mycobacterium bovis, прилагайки имунологични и молекулярни техники. Vet Mex. 2003; 34 (1): 13-26.

14 Stanley EC, Mole RJ, Smith RJ, Glenn SM, Barer MR, et al. Разработване на нов, комбиниран бърз метод, използващ фаг и PCR за откриване и идентифициране на жизнеспособни бактерии Mycobacterium paratuberculosis в рамките на 48 часа. Appl Envir Microb. 2007; 73 (6): 1851-1857.

15. Collins DM, May De Zoete, Cavaignac SM. Щамове Mycobacterium avium paratuberculosis от говеда и овце могат да бъдат разграничени чрез PCR тест, базиран на нова разлика в последователността на ДНК. J Clin Microb. 2002; 40 (12): 4760-4762.

16. Tripathi BN, Periasamy S, Paliwal OP, Singh N. Сравнение на PCR на тъкани IS900, бактериална култура, johnin и серологични тестове за диагностика на естествена паратуберкулоза при кози. Vet Microb. 2006; 116: 129-137.

17. Картър GR. Диагностични процедури във ветеринарната бактериология и микология. 1984; 4-то издание, издател Charles C Thomas, САЩ.

18. Erume J, Spergser J, Rosengarten R. Бързо откриване на Mycobacterium avium p aratuberculosis от говеда и зоологически животни чрез вложен PCR. African Health Sci.200; 1 (2): 83-89.

19. Collins MT, Scott JW, Petrini KR, Collins JE, Schultz RD, Whitlock RH. Оценка на пет теста за откриване на антитела за диагностика на паратуберкулоза по говедата. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12 (6): 685-692.

20. Kurstak E. Ензимна имунодиагностика. 1986. Канада, Academic Press.

21 Wells SJ, Collins MT, Faaberg KS, Wees C, Tavornpanich S, Petrini KR, et al. Оценка на бърз фекален PCR тест за откриване на Mycobacterium avium p aratuberculosis при млечни говеда. Clinic Vac Immunol. 2006; 13 (10): 1125-1130.

22 Stabel JR, Bannantine JP. Разработване на вложен PCR метод, насочен към уникален многокопиен елемент, ISMap02, за откриване на Mycobacterium avium paratuberculosis във фекални проби. J Clin Microb. 2005; 43 (9): 4744-4750.

23 Zimmer K, Dräger KG, Klawonn W, Hess RG. Принос към диагностиката на болестта на Джон при говеда. Сравнителни проучвания за валидността на оцветяването по Ziehl-Neelsen, фекалната култура и предлагания в търговската мрежа ДНК-сонда тест за откриване на Mycobacterium paratuberculosis във фекалиите от говеда. Zentralbl Vet Med B. 1999; 46 (2): 137-40.

24 Whittington RJ, Ian BM, Vanessa S, Grant IR, Juste R, Sevilla IA, et al. Култура Фенотипове на геномно и географски разнообразна Mycobacterium avium subsp. паратуберкулоза Изолати от различни гостоприемници. Clin Microbiol. 2011; 49 (5): 1822-1830.

Получено: 4-5-2012.
Приет: 1-17-2013.

Цялото съдържание на това списание, с изключение на случаите, когато е идентифицирано, е под лиценз Creative Commons