Серджо Уго Санчес-Родригес 1, Елена Донаджи Рамирес-Алварадо 2, Херардо Енрике Барахас-Васкес 3, Сесар Салвадор Кардона-Феликс 4

1 доктор по физиология. Отдел за клетъчна биология. Академично звено по експериментална биология. Автономен университет в Сакатекас.

2 магистър по биология. Отдел за клетъчна биология. Академично звено по експериментална биология. Автономен университет в Сакатекас.

3 магистър по биология. Отдел за клетъчна биология. Академично звено по експериментална биология. Автономен университет в Сакатекас.

4 Студент (Q.F.B.). Факултет по химически науки. Автономен университет в Сакатекас.

Автор-кореспондент: Серджо Уго Санчес-Родригес
Отдел за клетъчна биология
Електронна поща: [имейл защитен]

Резюме

Ключови думи

Hsp, стрес, среда за околната среда

Въведение

Всички организми страдат от стрес от околната среда и най-приспособените се адаптират, концепция, която предполага, че адаптацията е мярка за приспособяване на индивида към неговата среда; тоест адаптацията е степента, в която метаболитните процеси на индивида се адаптират към характеристиките на околната среда. [1]

По принцип терминът стрес се използва във физиологията, за да обозначи обратното на благосъстоянието. [2] По този начин стресът се разглежда като ефект на всяка сила, която има тенденция да разшири всеки хомеостатичен процес извън нормалните му граници на всяко ниво на биологична организация. [3]

Разбираемо е, че стресорът е агент, който предизвиква реакцията на стресовия модел, имайки не само физическа природа, но може да бъде и емоционален като омраза, гняв или страх, наред с други. Всъщност психологическата стимулация е един от най-честите й задействания. [4]

Стресът може да бъде климатичен, като силен студ или жега, хранителен, социален или болест. [5] В екологично отношение стресът се получава, когато физически, химични и/или биотични фактори изтласкват организма отвъд границите на неговата основна ниша. [3]

Неблагоприятните условия в организма, независимо дали се дължат на околната среда или на поведенческите му навици или на диетата му, се медиират чрез нервната и ендокринната системи и помагат на организмите да избегнат стреса. [6] Приспособяването към стреса предизвиква широк спектър от невроендокринни, психологически и поведенчески промени, които позволяват бързо възстановяване или адаптация, необходими за поддържане на вътрешната хомеостаза. [7,8]

Установено е също, че група протеини, известни като протеини на топлинен шок (Hsp) или стрес протеини, помагат на организмите на клетъчно ниво да противодействат на стреса. [9-14] Hsp се индуцират от различни стресови фактори, [15,16] сред които са: хипогликемия, аноксия, топлина, етанол, водороден прекис, йони на тежки метали, арсеник, инфекции с някои вируси, [17,18] автоимунни заболявания като системен лупус еритематозус, [19] поради лишаване от храна и вода, [20] ултравиолетово лъчение, нискочестотно електромагнитно лъчение, интензивни полета на гама лъчение [21,22] и гама лъчи с ниска интензивност. [2. 3]

Околната среда е стресов фактор за всички организми и по-специално, поради своя начин на живот, човек може да причини повече стрес на организма си поради навици или пристрастявания по време на тяхното развитие. Най-известните неблагоприятни навици са алкохолизъм, тютюнопушене, диетични разстройства, наркомания (различни), прекомерни физически упражнения, заседнал начин на живот и др.

В този проект беше проучено кои физиологични механизми активират индивидите, което им позволява да се адаптират към различни видове стрес като: физически упражнения, затлъстяване и химически агенти (тютюн и алкохол). За целта се фокусираме върху изследването на протеините с калоричен шок Hsp70 и 90, тъй като той се изразява по нормален начин във всички организми от бактерии, дрожди и хора. [13,24] Ролята на Hsp70 е да предпазва клетката от увреждане на стреса чрез свързване с частично денатурирани протеини, дисоцииране на протеинови агрегати и регулиране на правилното сгъване и вътреклетъчна транслокация на ново синтезирани протеини. [25,26] По същия начин функцията на Hsp90 предотвратява натрупването на протеини, които се разгъват по време на стрес и се свързват със стероидните хормонални рецептори, за да реагират бързо на сигнали, [27] играят важна роля в регулирането на ензимите и в транскрипцията на протеини. [28] Като цяло, Hsp90 служи като организатор, който обединява молекулите и подпомага тяхното свързване. [29]

Целта на настоящото проучване беше: Да се ​​определи степента на стрес, представен от лимфоцитите на спортисти, затлъстели, алкохолици и пушачи чрез експресията на протеините на топлинен стрес Hsp70 и 90.

материали и методи

Изследвани лица.

Избрани са лица със средна възраст между 18 и 22 години, мъже. Създадени бяха 4 групи от по 4 члена според състоянието и навиците им (пушачи, затлъстели, които поглъщаха алкохол значително и тези, които правеха интензивни физически упражнения, както и група здрави индивиди).

Получаване на лимфоцити.

Кръвни проби от изследваните индивиди са използвани за изолиране на лимфоцитите им. От всеки индивид се получават 10 ml периферна кръв (Beckton-Dickinson N.J., САЩ, 10 ml хепаринови епруветки). От получената кръв лимфоцитите се изолират чрез градиент Ficoll Histopaque (Sigma Chemical Co., St Louis MO, USA, 1077-1), следвайки техниката, описана от Boyum (1968). [30] Лимфоцитите на всеки индивид са култивирани в среда RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island NY, САЩ, 11876-026), допълнена със 100 U/ml пеницилин, 100 ng/ml стрептомицин (In Vitro, Мексико, DF), 0,08 U/ml инсулин (Eli Lilly México, DF) и 5% фетален говежди серум (Gibco BRL, Grand Island NY, САЩ, 16000-044). От всеки индивид жизнеспособността на лимфоцитите се определя от

време за получаването им, чрез техниката за изключване на трипан синьо (Sigma Chemical Co, Сейнт Луис, САЩ, T-6146).

Клетъчен стрес. Лимфоцитите на всеки индивид в среда RPMI бяха разделени на 3 аликвотни части. Аликвотна част беше взета като контрола за определяне на основното ниво на Hsp. друг е бил подложен на топлинен стрес в културна пещ при 40 ° С в продължение на 3 часа, а друг на UV светлина с помощта на UV-A светлинна лампа (Black-Ray лампа UVL-56). Облъчването беше 366 nm в продължение на 3 часа, чиято крайна доза беше 5-30 mJ/cm2. [31] След топлинен стрес и UV светлина, жизнеспособността на лимфоцитите беше отново определена.

Лизис на лимфоцити и SDS-PAGE: Лимфоцитите, подложени на ултравиолетови и топлинни натоварвания, се промиват 3 пъти с физиологичен разтвор на фосфат (PBS; рН 7,2) ((Gibco BRL, Grand Island NY, САЩ, 21300-058), добавят се 0,5 ml буфер. Лизис, съдържащ: 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl рН 7,6 и 1 mM инхибитор на протеаза, PMSF (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, P-7626 Лизатът се центрофугира за 10 минути при 1600 g и супернатантата се възстановява и се определя концентрацията на протеина. [32] Количественото определяне на протеина се извършва, използвайки техниката, описана от Bradford (1976). [33] За всяко условие експериментално, 30 μg протеин се характеризират в полиакриламидни гелове (10% SDS-PAGE) съгласно техниката, описана от Laemmli (1970). [34]

Западно петно ​​и имунодетекция: Протеините в SDS-полиакриламидните гелове бяха прехвърлени в нитроцелулозна хартия (Amersham Laboratories, Buckinghamshire, England, RPN303C), както е описано от Towbin (1979). [35] След това, за да се идентифицират Hsp протеините, петно ​​се третира със специфични моноклонални антитела срещу Hsp70 и 90 протеини (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, H-4149, H-5147) с разреждане 1: 1000. Като второ антитяло се използва конюгирано с пероксидаза антимиши IgG антитяло (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, A-9044), разреждане 1: 1500, последвано от хемилуминесцентна система за откриване (ECL, RPN2106, Amersham, Little Chalfont, Бъкингамшир, Англия), който е открит на рентгенографски филм BioMax (Eastman Kodak Co, Рочестър, Ню Йорк, САЩ, 870-1302) за време от 1 минута.

Определяне на количеството Hsp: Авторадиографиите, получени по метода ECL, бяха анализирани чрез денситометрия (Eagle Eye, Stratagene Mitsubishi), за да се определи количествено количеството протеин. Контролната стойност (здрави индивиди) се изважда от стресовите условия (алкохол, тютюн, затлъстяване и физически упражнения).

Статистически анализ: Протеиновите ленти Hsp70 и 90, получени в условията на стрес поради алкохол, тютюн, затлъстяване и физическо натоварване, бяха анализирани чрез денситометрия, получените резултати от това бяха изразени като средно ± s.e.m., където n е броят на наблюденията.

Резултати и заключения

Стресът е широк термин, който предполага реакцията на организма към заплаха, към която трябва да се адаптира. [7] Един от механизмите, чрез които клетките на организма реагират на стрес, са протеините от топлинен шок. [9,10,13,14,36] Основната точка на настоящото проучване беше да се оцени степента на стрес, представен от лимфоцитите на спортисти, затлъстели, алкохолици и пушачи чрез експресията на протеините на топлинен стрес Hsp70 и 90.

Установено е, че лимфоцитите, получени от изследваните пациенти, конститутивно експресират Hsp70 и 90, където алкохолици, пушачи и спортисти в базални условия изразяват повече Hsp70 от здрави и затлъстели индивиди (Фигура 1), докато Hsp90 се експресира много повече от Hsp70 в базални условия, което е по-очевидно при здрави индивиди, пушачи и спортисти (фигура 2). Важно е да се отбележи, че както Hsp70, така и 90 се намират основно в лимфоцитите, тъй като е известно, че тяхната експресия в повечето организми изпълнява характерните функции на клетъчната защита, помагайки да се предотврати денатурацията на протеини по време на стрес. протеини и тяхното правилно сгъване, както и при вътреклетъчна транслокация. [10,37]

стресиращия

Фигура 1. Експресия на Hsp70 и 90 при здрави индивиди (S), алкохолици (A), пушачи (F), затлъстели (O) и спортисти (D). Условията бяха: Контрол (C), стресиран с UV светлина, стресиран с топлина (40 ° C). PAGE-SDS

Фигура 1. Базова и/или конститутивна експресия на Hsp70 на лимфоцити от здрави пациенти, пушачи, алкохолици, пациенти със затлъстяване и спортисти. денситометрия на контролите, получени чрез PAGE-SDS.

Фигура 2. Базална и/или конститутивна експресия на Hsp90 на лимфоцити от здрави пациенти, пушачи, алкохолици, пациенти със затлъстяване и спортисти. денситометрия на контролите, получени чрез PAGE-SDS.

За да се събуди клетъчната реакция на лимфоцитите към стрес и да се измери тяхната реакция чрез експресията на Hsp, лимфоцитите бяха подложени на стрес с ултравиолетова светлина, където се наблюдава увеличение на експресията на Hsp70 при алкохолици и спортисти, докато за Hsp90 е по-високо при спортни индивиди (фигура 3 Y. 4). По същия начин в настоящото проучване калоричният стрес се използва като контрола, тъй като той е индуктор на експресия на hsp70. [13,14,27] Отговорът на лимфоцитите към топлина беше чрез експресията на Hsp70 и 90, които бяха сходни при здрави индивиди, пушачи и затлъстели, с увеличаване на алкохолиците и спортистите (фигура 3 Y. 4). Известно е, че една от функциите на hsp70 при стресови условия е да се свързва с увредени пептиди и протеини, за да предотврати тяхното агрегиране, допринасяйки за тяхното възстановяване и като по този начин предпазва клетката от въпросния стресор. [38,39]

Фигура 3. Експресия на Hsp70 в лимфоцити, изложени на ултравиолетова светлина и топлина. Здрави индивиди, алкохолици, пушачи, затлъстели и спортисти. PAGE-SDS денситометрия.

Фигура 4. Експресия на Hsp90 в лимфоцити, изложени на ултравиолетова светлина и топлина. Здрави индивиди, алкохолици, пушачи, затлъстели и спортисти. PAGE-SDS денситометрия.

Предишните резултати показват, че експресията на съставните Hsp70 и 90 и на новия синтез чрез индукция с ултравиолетова светлина и топлина присъства във всички лимфоцити на изследваните индивиди, както от здрави пациенти, така и от алкохолици, затлъстели, пушачи и индивиди спортист, потвърждавайки това, което други автори са открили, че тези протеини се синтезират по време на стрес. [40]

В настоящото проучване, когато събуждаме отговора с ултравиолетова светлина и топлина в лимфоцитите на лица, изложени на стресови агенти като алкохол, тютюн и интензивни физически упражнения, наблюдаваме по-висок синтез на Hsp, което показва, че лимфоцитите на изложени индивиди на определени стресови фактори те развиват по-голяма реакция при синтеза на Hsp. Това явление се наблюдава при някои организми, изложени на голям брой стресови фактори като температура, което ги кара да придобият толерантност към широк спектър от стресови фактори. [41] В допълнение, Hsp70 е от съществено значение при предварителното кондициониране на определен стрес, тъй като индуцирането на Hsp70 е свързано със защита от последващи повреди. [17,42,43] Синтезът на Hsp протеини е необходим в зависимост от температурата или стресора, за който става дума, и варира при различните видове. [9,10]

Като цяло се наблюдава увеличаване на синтеза на Hsp70 и 90 протеини, което показва, че тези протеини помагат за противодействие на стреса, тъй като е установено, че Hsp70 се намира във всички изследвани организми, от бактерии, дрожди и човека, повсеместно разположени в клетки, чиято основна функция е в транспорта и свързването на разгънатите протеини и тяхната корекция. [44] Hsp70 е първият белтък, наблюдаван като индуцируем от стресори като топлина, наред с други. [13] Споменава се, че организмите с толерантност към топлина изразяват повече Hsp от по-малко толерантния организъм. [Четири пет]

От друга страна, Hsp90 принадлежи към конститутивно по-експресираните цитозолни шаперони, особено в еукариотните клетки, [13,24], чиито функции са да предотвратяват агрегирането на денатурирани от температурата протеини, заедно с клетъчни компоненти като рецептори на стероидни хормони., [27,46,47] също играят важна роля в регулирането на ензимите и транскрипцията на протеини в клетката. [28]

Лимфоцитите от пушачи, алкохолици и спортисти изразяват повече Hsp, отколкото здрави (контролни) и затлъстели пациенти. Това е в съответствие с други проучвания, при които е установено, че съществува тясна връзка между повишената експресия на Hsp и експресията на цитохром Р-450 по време на стрес поради упражнения, тютюнопушене и алкохолизъм. По време на стрес, експресията на Hsp заедно с цитохром P-450 (CYP2E1: метаболизира полициклични съединения „диоксини“) помагат за противодействие на стреса. [48]

Упражненията, както и други стресови фактори като хипертермия, исхемия, оксидативен стрес, ниско ниво на глюкоза и промени в калция и рН, предизвикват експресията на Hsp в клетките и тъканите. [49] В настоящото проучване открихме увеличение на Hsp70 и 90 протеини при индивиди, които практикуват физически упражнения и това корелира с това, което се съобщава от други автори, че интензивното и продължително упражнение увеличава синтеза на Hsp в органи като сърцето и скелетна мускулатура. [50] Това се обяснява с факта, че по време на тренировка свободните радикали се увеличават и са последвани от увеличаване на експресията на антиоксидантните ензими и увеличаване на експресията на Hsp, което показва, че увеличаването на редокс състоянието на мускула може да упражни сигнал за адаптация. [51,52] Упражнението предизвиква изразяването на Hsp, благоприятно влияещо върху здравето. [50,53-56]

Като цяло, Hsp протеините участват като механизъм на устойчивост на стрес, като са често срещани във всички организми, което им дава устойчивост на редица стресори; [6,41], което означава, че високите температури или други видове стресови фактори помагат на организмите в бъдещи стресови условия да имат по-голяма устойчивост. Това е свързано с факта, че поносимостта на организмите към стресор може да бъде естествена или индуцирана [38], където синтезът на Hsp участва като механизъм на клетъчна реакция. [36] Изразът на Hsp варира в зависимост от начина на живот, който хората водят, помагайки за противодействие на стреса.