БИБЛИОГРАФСКИ ПРЕГЛЕД ЗА ПОЛИТИЛИЛЕН МИКРОГРАДИНГ МИКРООРГАНИЗМИ И НЕГОВИТЕ ВЪЗДЕЙСТВИЯ ВЪРХУ МАТЕРИАЛА Нелсън Рикардо Акуня Молина 2017 г.
БИБЛИОГРАФСКИ ПРЕГЛЕД ЗА ПОЛИТИЛИЛЕН МИКРОГРАДИНГ МИКРООРГАНИЗМИ И НЕГОВИТЕ ВЪЗДЕЙСТВИЯ ВЪРХУ МАТЕРИАЛА Нелсън Рикардо Акуня Молина ДОПЪЛНИТЕЛНА РАБОТА ЗА ОТБОР ЗА СТЕПЕНТА В ХИМИЯТА Режисьори: Хорхе Алонсо Ленаси Рожас Сърежисьор: д-р Марио Санчес Родригес. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS ФАКУЛТЕТ НА НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЕ УЧЕБЕН ПРОГРАМА НА БАКАЛАВЪР В ХИМИЯ BOGOTA D.C. 2017 I
Бележка за приемане Председател на журито Жури Богота D.C. (01 март 2017 г.) II
Посвещение на майка ми и на всички учители, които насърчиха и засилиха любопитството и любовта ми към науката, както и на онези, които ме насочиха и ми помогнаха да придобия научните си знания и умения. III
ПРИЗНАНИЯ Благодаря на майка ми за нейната постоянна подкрепа, на учителите ми за всичките им учения, особено на моите директори и съдиректори Хорхе, Джозуе и Марио за усилията и подкрепата, на всички мои приятели, които допринесоха по някакъв начин със своите съвети и предложения. в реализацията на тази работа, особено Дейвид Леонардо Кастила и Нестор Александър Замбрано, които любезно допринесоха чрез своите отзиви и предложения. IV
СЪДЪРЖАНИЕ Списък на таблици X Списък на фигури XI Списък на фигури XIII Списък на приложения XIV Съкращения XV Речник XVI 1. РЕЗЮМЕ 1 2. ВЪВЕДЕНИЕ 2 3 ЦЕЛИ 2 3.1 Общи цели 2 3.2 Специфични цели 3 4. ПРЕДШЕСТВАЩО И ОБСТОЯТЕЛСТВО 3 4.1. Дефиниция на проблем 3 4.2. Исторически преглед 4 4.3 Алтернативи за контрол на LDPE 5 4.3.1 Погребване в депа за LDPE 5 4.3.2 Изгаряне на LDPE 5 4.3.3 Пиролиза на LDPE 6 4.4. Политики за рециклиране 6 4.4.1 Проблем с околната среда, причинен от LDPE 7 5 ТЕОРЕТИЧНА РАМКА 7 5.1 Полимери 8 5.1.1 Пластмаси 8 5.1.2 Полиолефини 8 5.1.2.1.1 Полиетилен (PE) 8 5.1.2.1.2 Класификация на PE 8 5.1 .2.1.2.1 Полиетилен с ниска плътност (LDPE) 9 5.1.2.1.2.2 Линеен полиетилен с ниска плътност или (LLDPE) 9 5.1.2.1.2.3 Полиетилен с висока плътност (HDPE) 9 5.1.2.1.2.4 Причини за химическата инертност на полиетилен 10 5.2 Биополимери заместители на LDPE 10 5.2.1 Естествени биополимери 10 5.2.2 Синтетични биополимери 10 5.2.3 Биопластика 11 5.2.3.1 Напълно биоразградима биопластика 11 5.2.3.2 Биоразградима биопластика 11 5.3 Биоремедиация 11 5.3.1 Биоразграждане на ниски плътност полиетилен 11 (LDPE) 5.3.1.1 Биодетериорация 12 5.3.1.2 Асимилация 12 V
5.4.2.6.1 Жизнеспособност на микробния биофилм 62 5.4.2.6.2 Предварителни тестове за характеризиране 62 5.4.2.6.3 Специфични тестове за идентификация 62 5.4.2.7 Продукти на биоразграждане 62 5.5 Предложена методология 63 5.5.1 Тест за жизнеспособност микроорганизми 64 жизнеспособни на плоча разреждане 5.5.1.1 Вземане на проби и селекция на LDPE-разграждащи микроорганизми в SM течна среда 5.5.1.2 Предварителна идентификация 65 5.5.1.3 Предварителни тестове за идентификация на гъбички 66 5.5.1.4 Тест за биоразграждане in vitro 67 5.5.2 Тест за загуба на маса 67 5.5.3 Специфична идентификация 67 5.5.3.1 Техника 69 полиморфизми с дължина на рестрикционни фрагменти (RFLP) 5.5.4 Инструментални тестове 69 5.5.4.1 Прилагане на FTIR за изследване на биоразграждането на LDPE 69 5.5.4.1.1 Варианти на техниката 69 5.5.4.1.1.1 FT-IR ATR спектроскопия 69 5.5.4.1.1.2 FT-IR дифузно отражение (DRIFT) 70 5.5.4.1.2 Индекси за количествено определяне на окислението 70 5.5 .4.1 .2.1 Карбонилен индекс (CI) 70 5.5.4.1.2.2 Винилов индекс (IV) 70 5.5.4.1.2.3 Процент (%) на кристалност на LDPE 70 5.5.4.2 Газова хроматография, свързана с 71 GCMS масспектроскопия 5.5.4.2 .1 Количествено определяне на производството на CO 2 71 6 АНАЛИЗ 72 7. ЗАКЛЮЧЕНИЯ 77 8. ПРЕПОРЪКИ 78 9. БИБЛИОГРАФИЯ 79 65 IX
СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ Фигура 1 a Линеен полиетилен с ниска плътност (LLDPE) 9 Фигура 1 b Полиетилен с ниска плътност (LDPE) 9 Фигура 1 c Полиетилен с висока плътност HDPE 9 Фигура 2 Фактори, влияещи върху биоразграждането на LDPE 13 Фигура 3 Пътища хипотетична трансформация на полиетилена до неговата пълна минерализация 14 Фигура 4. Биоразграждане на PE чрез β-окисление 14 Фигура 5 Инициатори на PE окисление 15 Фигура 6 Механизъм на хемолитична руптура или фотолиза 16 Фигура 7 Иницииране от метален агент 16 Фигура 8 Разпространение на фотоокисление 17 Фигура 9 a Механизми на окисление след реакциите на Norrish тип 1 и 2 17 Фигура 9 b Окисление за образуване на мастни киселини или 17 естери Фигура 10 Налични техники и методи за изследване на разграждането на LDPE 37 Фигура 11 Предложена основна методологична схема 64 Фигура 12 Предварителни методи на метаболитна идентификация 66 Фигура 13 Методология, която трябва да се извърши за конкретната идентификация a 68 Фигура 14 Процедура за изолиране на LDPE биоразградими микроорганизми Фигура 15 Процедура за култивиране, изолиране и идентифициране на LDPE разграждащи микроорганизми 100 101 XI
СПИСЪК НА ГРАФИКАТА Страница Графика 1. Вариация в световното производство на пластмаси от 1950 до 2010 г. Графика 1. B Вариация в световното производство на пластмаси от 1950 до 2013 г. Графика 2. Дял на докладваните жанрове, свързани с биоразграждането на (LDPE) Графика 3. Техники най-често се използва за изследване на биоразграждането на LDPE 4 4 75 76 XIII
СПИСЪК НА ПРИЛОЖЕНИЯТА ПРИЛОЖЕНИЕ А1. ПРИЛОЖЕНИЕ А2. ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Изолиране и преброяване на LDPE биоразградими микроорганизми Култура на LDPE биоразградими микроорганизми Пречистване на LDPE биоразградими микроорганизми 100 101 102 ПРИЛОЖЕНИЕ C Тест за биоразграждане на LDPE 103 ПРИЛОЖЕНИЕ D Екстракция на ДНК от гъби 104 ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Екстракция на ДНК от бактерии 105 ПРИЛОЖЕНИЕ F. Дискриминация между микробни групи, използващи RFLP 106 ПРИЛОЖЕНИЕ G1. Тестове за идентифициране на бактерии 107 ПРИЛОЖЕНИЕ G2. Тестове за бактериална идентификация 108 ПРИЛОЖЕНИЕ G3. Тестове за бактериална идентификация 109 ПРИЛОЖЕНИЕ G4. Тестове за идентифициране на бактерии 110 ПРИЛОЖЕНИЕ H Списък на веществата за среда и тестове 111 ПРИЛОЖЕНИЕ I Предложена процедура за сеитба 114 ПРИЛОЖЕНИЕ J1 Таблица с предварителни характеристики на бактериите 115 ПРИЛОЖЕНИЕ J2 Предварителни характеристики на бактериите 116 ПРИЛОЖЕНИЕ J3 Предварителни характеристики на бактериите 117 ПРИЛОЖЕНИЕ K1 Процедура за анализ на полиетилен с използване FTIR ПРИЛОЖЕНИЕ K2 Процедура за анализ на полиетилен, използвайки FTIR ПРИЛОЖЕНИЕ L1 Количествено определяне на производството на CO 2 и идентификация на метаболити ПРИЛОЖЕНИЕ L2 Количествено определяне на производството на CO 2 и идентификация на метаболити 118 119 120 121 XIV
5.1.2.1.2.1 Полиетилен с ниска плътност LDPE Структурата му е силно разклонена (в около 2% от въглеродните атоми) [51]. Молекулното му тегло е 100 000-300 000 [g/gmol], а плътността му е 0,90-0,91 [gr/cm 3], което е най-ниската плътност и това се отразява в реологичните му качества, използва се при производството на торбички за еднократна употреба. 5.1.2.1.2.2 Линеен полиетилен с ниска плътност или (LLDPE), който е вариант с малко разклонение, може да бъде класифициран като междинна кристалност, като стойността от 0,915 g/cm 3 е относително компактна. 5.1.2.1.2.3 Полиетилен с висока плътност (HDPE) Структурата му е с най-висока степен на линейност, молекулното му тегло е 200 000-400 000, [g/gmol], а плътността е 0.94-0.97 0.91 -0.94 [gr/cm 3], поради това е много твърд и здрав материал, който се използва при производството на пластмасови кутии. а) б) 1000 в) 4000 1000 Фигура 1 структури от полиетилен, а) линеен полиетилен с ниска плътност (LLDPE); б) полиетилен с ниска плътност (LDPE); в) полиетилен с висока плътност HDPE. 9
степен на окисление на материала и вида на добавената добавка, която може да бъде нишесте или прооксиданти. В резултат на докладваните работи е извършен хипотетичен механизъм за биоразграждане, който е показан по-долу. Фигура 3 Хипотетични пътища на трансформация на полиетилена до пълната му минерализация въз основа на изделията от [63, 45, 68]. Фигура 4 Биоразграждане на PE чрез източник на β-окисление [65] 14
Авторът е наясно колко трудоемко и скъпо може да бъде извършването на толкова много тестове, както предварителната идентификация, така и конкретната идентификация могат да продължат месеци или може би години. Основната методологична структура ще бъде следната: Фигура 11 Предложена основна методологична схема 5.5.1 Брой тестове за жизнеспособност на жизнеспособни микроорганизми чрез разреждане на плочата Предлагат се тест за жизнеспособност или разреждане на плочата и броят на образуващите колонии единици, тъй като е лесен и бърз, а също така позволява отделянето и индивидуализацията на хидрокарбонокластните видове микроорганизми (поне тези, които могат да оцелеят in vitro). (Виж ПРИЛОЖЕНИЕ L2) Изчисления 1) Бройте само онези кутии (разреждания), които съдържат от 30 до 300 колонии. 2) Със следното уравнение изчислете CFU/g s.s. CFU/g пе. = (NC 1/FD 1/V)/(P FH). Къде: CFU/g pe. = единици, образуващи колонии/g PE. NC = брой колонии в кутия. FD = коефициент на разреждане, който съответства на разреждането, от което е взета пробата, с която е инокулирана кутията (10-2 до 10-10). V = обем, инокулиран в кутията = 0,1 ml. P = тегло на мократа проба = 1 g. FH = коефициент за корекция на влажността (1 (% влажност/100)). 64
5.5.1.1 Вземане на проби и селекция на LDPE разграждащи микроорганизми в SM течна среда Предлага се да се направи селективна SM течна среда, тъй като тя е идеална за развитието на LDPE биоразградими микроорганизми, а също така е тествана в множество изследвания за биоразграждане, което генерира надеждност. Вземане на пробата Предварителна обработка на пробата Добавяне към течната културална среда Инкубация (виж ПРИЛОЖЕНИЕ А 2). 5.5.1.2 Предварителна идентификация За идентифициране на бактериалните родове могат да се проведат следните биохимични и микробиологични тестове, като каталаза, за бактерии (вж. ПРИЛОЖЕНИЕ G1). да се. Тиогликолатен бульон OF; б. Тест за оксидаза c. Тест за каталаза d. Malonate тест д. Цитратен тест j. Тест за ферментация, 2,3-бутандиол и смесена киселина. F. Тест за хипурат g. Тест на Клиглер h. Tsi желязо три захари i. MR/VP тест k. Лизин железен агар л. Фенилаланин деминаназен агар m. Moeller n. Декарбоксилиране на аминокиселини 65
Фигура 12 Предварителни методи за метаболитна идентификация 5.5.1.3 Предварителни тестове за идентификация на гъбички За гъбичките ще бъдат проведени следните тестове: За изолирането и преброяването на гъби, разграждащи РЕ, беше използвана същата техника и среда като за бактериите, с разликата, че Роза Бенгалия и стрептомицин се добавят към средата и рН се коригира на 4,9 [187]. За тяхното култивиране могат да се използват агар sabouraud, PDA, лактофенолов син памук (LPCB) и за тяхното идентифициране се използват микроскопско и макроскопско наблюдение. 66
Аликвотни части на амплифицирания ген в резултат на PCR с тези универсални праймери могат да бъдат секвенирани евтино в търговски лаборатории или в много случаи в университетски лаборатории. След като последователността на гена rrna е известна, те могат да бъдат използвани за идентифициране на първоначалните микроорганизми на ниво род и вид [271]. Последователностите на огромен брой бактериални видове са компютъризирани в бази данни [271]. Това позволява сравнение на неизвестна rrna последователност с известна бактериална последователност [271]. Налични са много програми за анализ на последователности, които помагат да се идентифицират последователностите. Една такава база данни е BLAST (Основен инструмент за локално търсене на подравняване), който означава местен инструмент за търсене на основно подравняване, който се предоставя от (NCBI) Национален център за биотехнологична информация, който е достъпен в мрежата [271]. Универсални грундове 16S rrna взети от [271]. 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGY * TACCTTGTTACGACTT * Y може да бъде C или T дегенерирана базова позиция. Фигура 13 Методология, която да се използва за специфична идентификация 68
те ограничават употребата им [67], което е необходимо подобрение дори в тях. Когато всички тези бариери бъдат преодолени, със сигурност скоро проблемът може да бъде окончателно решен или да възникнат други нови проблеми, само времето ще покаже, но злоупотребата, безотговорността и безсъзнанието на нашите действия като общество все още ще бъдат и трябва да бъдат проблемите за изкореняване от умовете на обществото. Истината е, че макар да са най-докладвани, това не означава, че те са най-добре вършещи тази работа, просто че са най-повсеместните до момента. Без съмнение Aspergillus sp. Те са най-повсеместните микроорганизми, разграждащи полиетилен, открити до момента, като са много далеч от останалите родове с 81 вида, което показва, че гъбите са много гъвкави и неизискващи към околната среда, храната и условията, освен че са много популярни сред изследователите. Графика 2 брой референции, получени от род гъби и бактерии, които са свързани с биоразграждането на (LDPE). 75
ПРИЛОЖЕНИЕ A1 Изолиране и преброяване на LDPE разграждащи микроорганизми Фигура 14 Процедура за изолиране на LDPE биоразградими микроорганизми, адаптирана от [187, 94] За изолирането и преброяването на PE разграждащи гъби се използва същата техника и среда като за бактериите. С разликата тази роза Бенгалия и стрептомицин се добавят към средата и рН се коригира на 4,9. 100
ПРИЛОЖЕНИЕ А2 Изолиране и идентифициране на LDPE разграждащи микроорганизми Фигура 15 Процедура за култивиране, изолиране и идентификация на LDPE разграждащи микроорганизми. 101
ПРИЛОЖЕНИЕ Б Пречистване и изолиране на LDPE разграждащи микроорганизми Фигура 16 Процедура за изолиране на LDPE разграждащи се микроорганизми и тяхното последващо размножаване за извършване на ДНК екстракция. За да се извлече гъбична ДНК, тя не трябва да се засява върху агар, тъй като остъргването оставя следи от среда, която пречи на екстракцията на ДНК. Предложеният метод е този, регистриран от Rojas Triviño [276] 102
ПРИЛОЖЕНИЕ C Тест за биоразграждане на LDPE Фигура 17 Тест за биоразграждане in vitro, адаптиран от [237, 126] 103
ПРИЛОЖЕНИЕ Г Екстракция на ДНК от гъби Фигура 18 Предложеният метод е този, регистриран от Махаку, модифициран от [203]. 104
ПРИЛОЖЕНИЕ E Екстракция на ДНК от бактерии Фигура 19 Метод за извличане на ДНК е този, регистриран от Международния център за тропическо земеделие-CIAT с използване на екстракционен буфер (CTAB) Таблица 16, необходими реагенти със съответните им концентрации, взети от [276] Количество на концентрацията на реагента NaCl 5M 14mL EDTA ph 8.0 0.5M 2.0 ml Tris-HCl ph8.0 1M 5mL SDS - 0.5g Стерилна дестилирана вода Долива до 50mL Количество концентрация на реагент NaCl 1.4M 8.18mL EDTA ph 8.0 20mM 4, 0 ml Tris-HCl ph8.0 100mM 10mL CTAB 2% 2g PVP 40 1% 1g Фигура 20 Количествено определяне на микробна ДНК 105
ПРИЛОЖЕНИЕ F PCR Дискриминация между микробни групи с използване на полиморфизъм на дължина на рестрикционния фрагмент (RFLP) Фигура 21 методологично предложение за изпълнение на RFLP техника, взета и адаптирана от [277]. 106
ПРИЛОЖЕНИЕ G1 Тестове за бактериална идентификация Фигура 22 бактериална идентификация с помощта на теста LIA agar, Kligler, тиогликолат и триптофан. 107
ПРИЛОЖЕНИЕ G2. Тестове за бактериална идентификация Фигура 23 Тестове за микробна идентификация, форми за нишесте, TCI, каталазна оксидаза 108
ПРИЛОЖЕНИЕ G3 Тестове за бактериална идентификация Фигура 24 Тестове за декарбоксилиране на лизин или орнитин, фенилаланин деаминаза 109
ПРИЛОЖЕНИЕ G4 Фигура 25 ЯМР VP, OF и тестове за ферментация на глюкоза 110