Субекти

Тази статия е актуализирана

Обобщение

Въведение

Затлъстяването е достигнало епидемични размери по целия свят, като най-малко 2,8 милиона души умират всяка година в резултат на наднормено тегло или затлъстяване (СЗО). Затлъстяването също представлява най-важният рисков фактор за инсулинова резистентност, сърдечно-съдови заболявания и диабет тип 2 (T2D) 1. Пациентите с T2D обикновено са хипергликемични и страдат от усложнения като хипертония, инсулт, атеросклероза и рак 2. Стратегии, които намаляват затлъстяването, обещават да намалят смъртността и да подобрят качеството на живот на засегнатите хора.

Ние показахме, че системното приложение на билирубин повишава инсулиновата чувствителност чрез потискане на ER стреса и възпалението при DIO 35 мишки. Сега разширихме тези наблюдения и изследвахме дали билирубинът регулира липидния метаболизъм, както се наблюдава при пациенти с болест на Gilbert 34 и дали билирубинът регулира серумните нива на адипокин при DIO мишки. Също така оценихме дългосрочните ефекти на лечението с билирубин върху липидния метаболизъм и нивата на адипокин 7 седмици след завършване на лечението с билирубин.

Резултати

Прилагането на билирубин намалява телесното тегло и подобрява инсулиновата резистентност при DIO мишки

Таблица в пълен размер

инсулиновата

( да се ) Чернодробни тегла на мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW. ( б ) Епидидимални мазнини от DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки. ( ° С ) Вакуолни фракции в черния дроб на мишки DIO + BR, DIO + V или CHOW. ( д ) Диаметри на мастните мехурчета (µm) на епидидималните адипоцити на DIO + BR, DIO + V или CHOW. ( и ) Представителни микроснимки на H&E оцветяване на чернодробни и мастни тъканни секции от мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW. Мащабна лента = 200 μm. Поне 3 мишки бяха тествани във всяка група; * стр

Нива на серумен TC ( да се ), LDL ( б ), HDL ( ° С ), TG ( д ), лептин ( и ), адипонектин ( F ), Общ билирубин ( ж ) и директен билирубин ( з ) при DIO + BR, DIO + V или CHOW мишки се измерват в серум веднага след завършване на лечението с билирубин. Всяка група съдържа 3-4 мишки; Данните са средни ± стандартно отклонение; *** стр

Относителната експресия на mRNA на инсулиновия рецептор (Insr) ( да се ), SREBP-1 ( б ), Fasn ( ° С ) и ACC ( д ) в черен дроб на DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки, измерено чрез RT-PCR анализ. Стойностите представляват относителната експресия на целевия ген в сравнение с експресията на ендогенния контрол. ( и ) Експресия на PPARy и C/EBPα протеин, определен в черния дроб на DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки чрез Western blot анализ. Геловете са били пускани при същите експериментални условия и са показани изрязани петна. ( F ) Относителна експресия на протеин на PPARγ и ( ж ) C/EBPα спрямо контрола на глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназата (GAPDH) (софтуер NIH ImageJ). Анализирани са проби от 3 отделни мишки. Данните са средни ± стандартно отклонение; *** стр

( да се ) Телесно тегло на мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW по време на 9-седмичния експеримент. ( б ) Серумни нива на глюкоза при DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки по време на 9-седмичния експеримент. Черен дроб ( ° С ) и тегло на мастна тъкан на епидидима ( д ) измерена 7 седмици след завършване на лечението. ( и ) (вляво) GTT на DIO мишки, измерени 7 седмици след завършване на лечението; (вдясно) стойности на площта под кривата над базовата линия; ( F ) (вляво) ITT на DIO мишки, измерени 7 седмици след завършване на лечението; (вдясно) стойности на обратната площ на кривата под базовата линия. Във всяка група бяха включени поне 3 мишки. Данните са средни ± стандартно отклонение; *** стр

Най-драматичното откритие на това проучване е, че лечението с билирубин понижава нивата на общия холестерол при DIO мишки. Намалението може да се дължи на промени в нивата на HDL и LDL, въпреки че намаленията на тези елементи не достигат статистическа значимост. Тези открития са в съгласие с наблюденията при лица със синдром на Gilbert, тъй като леко повишените нива на билирубин са свързани с намалени нива на общия холестерол, LDL и триглицериди и са свързани с намален провъзпалителен статус и намалена експозиция., 37, 38, 39. Въпреки че не наблюдаваме промяна в концентрациите на триглицериди при лекувани с билирубин мишки 14 дни след лечение с билирубин, се наблюдава намаление 7 седмици след лечението, което показва, че въздействието на билирубина върху нивата на триглицеридите може да се забави. Нашето проучване предостави доказателства, че екзогенно прилаганият билирубин е свързан с променен липиден профил при затлъстели мишки.

Установихме, че приложението на билирубин значително намалява нивата на лептин при DIO мишки. Приемът на храна от лекувани с билирубин DIO мишки не изглежда да е фактор по време на лечението с билирубин и не е наблюдавана разлика в приема на храна след края на лечението. Намаляването на нивата на лептин при мишки, лекувани с билирубин, може да бъде причинено от намаляване на мастната тъкан, както се поддържа от намалена експресия на SREBP-1. От значение са още две наблюдения: известно е, че лептинът увеличава възпалението чрез регулиране на TNF-α 40, а лечението с билирубин намалява експресията на TNF-α при DIO 35 мишки. Следователно е разумно да се предположи, че ефектите на билирубина върху затлъстяването са следствие от промяната на липидния синтез, намаляването на нивата на лептин и намаляването на производството на TNF-α. От клинично значение билирубинът трябва да бъде изследван като потенциално лечение за намаляване на липидния синтез, както се предполага от проучвания при хора 34 .

В това проучване установихме, че краткосрочното лечение с билирубин е свързано с намаляване на общия холестерол и увеличаване на PPARy и адипокини. Тези открития предоставят механични доказателства, че промененият метаболизъм на билирубин или билирубин (например частични инхибитори на UGT1A1 49) може да бъде полезен като терапевтичен подход за намаляване на затлъстяването и подобряване на инсулиновата резистентност и толерантност към инсулин.

Методи

Животните

Мъжки мишки C57BL/6 (на 6 седмици) са закупени от Института по генетика и биология на развитието към Китайската академия на науките (Пекин, Китай). Мишките са хранени с високо съдържание на мазнини (Таблица 1) или със стандартна CHOW диета (10% от калориите от мазнини) в продължение на 24 седмици преди лечението. Комитетът за грижи за животните от Циндаоския аграрен университет одобри всички експерименти с животни. Методите бяха проведени в съответствие с одобрените насоки.

Приготвяне и приложение на билирубин.

Билирубин (Frontier Scientific, Logan, UT) се разтваря в 0,1 N NaOH и рН се коригира до 7,4, като се използва НС1. Билирубин се прилага интраперитонеално 20 μmol/kg (11,7 mg/kg) два пъти дневно в продължение на 14 дни. Контролирайте DIO или CHOW мишки, получили носител по същия график на инжектиране.

Мониторинг на мишки след лечение.

Серумните нива на кръвната захар на гладно и телесното тегло на мишките се измерват ежедневно в 9:00 сутринта. Капка пълна кръв (приблизително 5 до 10 µl) се събира от минимален разрез в опашката от края на мишката и се анализира с глюкометър Sannuo (San Nuo Inc., Changsha, Китай). Физическите дейности на мишките (включително поведение, прием на храна, консумация на алкохол и близане) се наблюдават ежедневно, както е описано 35. Приемът на храна (с изключение на излива) се измерва в продължение на 24 часа на 7 дни след лечението и седмично в продължение на 7 седмици след лечението с билирубин.

Интраперитонеален глюкозен толеранс (IPGTT) и инсулинов толеранс (ITT)

За IPGTT, мишките се гладуват цяла нощ и след това се инжектират с 2 g/kg глюкозен разтвор (ip). За ITT мишките бяха на гладно в продължение на 5 часа и след това се инжектираха с 0.75 U/kg инсулин (ip; Eli Lili, Indianapolis, IN). Нивата на серумна глюкоза в кръвта са измерени на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектиране на глюкоза или инсулин.

Събиране на тъкани, подготовка на серум и химия на кръвта.

В края на всеки експеримент мишките се анестезират и кръвта се събира чрез ретроорбитално кървене в хепаринизирана тръба. Плазмата се получава чрез центрофугиране и се съхранява при -80 ° С за по-късен анализ. Мишките бяха евтаназирани и черният дроб и мастните тъкани на епидидима бяха отстранени, претеглени и замразени в течен азот за по-нататъшен анализ. Серумните нива на TC, TG, HDL, LDL и билирубин бяха измерени с помощта на специфични комплекти реактиви (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). Нивата на лептин, инсулин и адипонектин са измерени чрез ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Анализ в реално време (RT) -PCR

Експресията на инсулиновия рецептор, лептиновия рецептор, аполипопротеин A-IV (Apoa4) и SREBP-1 в черния дроб се определя количествено чрез RT-PCR анализ, както е описано по-горе [50]. Експресията на β-актин се определя количествено чрез RT-PCR във всяка проба и се използва като ендогенен контрол. RT-PCR грундове в реално време са закупени от Life Technologies (Invitrogen Trading Co., Ltd., Шанхай, Китай).

Анализ на Western Blot

Съдържанието на протеин в целите клетъчни лизати се определя количествено чрез BCA анализ и 30 μg протеин от всяка проба се отделя върху 4-12% Bis-Tris гел (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China). Протеините бяха прехвърлени в мембрана Hybond-P (GE healthcare, Piscataway, NJ), блокирани с 5% обезмаслено мляко и инкубирани със следните първични антитела: PPARγ, C/EBPα (Abcam, САЩ). И GAPDH (Санта Круз) Biotechnology Inc., САЩ), в продължение на една нощ при 4 ° С. След това петна се изследват с маркирани с хрян пероксидаза вторични антитела (Sangon Biotech Ltd., Шанхай, Китай) 45 минути при стайна температура и се визуализират от ECL комплект за откриване (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Великобритания). Интензитетът на всеки сигнал се определя с помощта на софтуера Image J (NIH).

Оцветяване от хематоксилин и еозин (H&E)

Имунохистохимията на черния дроб на мишката и епидидималната мастна тъкан се извършват, както е описано [35]. Накратко, секциите на черния дроб или мастната тъкан бяха фиксирани в 10% буфериран формалин за една нощ, вградени в парафин и разделени. Слайдовете се накисват във филтриран хематоксилин за 6 минути, изплакват се с вода и еозинът се оцветява за още 1-2 минути. Секциите бяха изплакнати с вода и дехидратирани във възходящи алкохолни разтвори, изплакнати с ксилол и монтирани с покривно стъкло върху етикетирано стъклено стъкло. Слайдовете бяха изследвани с трансфлективен микроскоп с двойна употреба Olympus BX51 (Olympus, Токио, Япония) и изображенията бяха заснети с цифров фотоапарат Olympus DP72. Площта на вакуолата в областта на общата чернодробна тъкан се определя в черния дроб с помощта на софтуера за анализ Image-Pro Plus. Отделни диаметри на мастните клетки (n = 75 във всяка група) бяха измерени с помощта на стандартен софтуер CellSens (Olympus).

статистически анализ

Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение. Разликите между две групи бяха сравнени за статистическа значимост, използвайки несдвоени t-тестове на Student с корекция на Bonferroni. Разликите се смятаха за значими, когато p