чревната

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Разграждане на кофеина в H. hampei
  • Биогеографски анализ на микробиома на H. hampei
  • Бактерии, които разграждат кофеина в червата на H. hampei
  • Кислородни профили в червата на H. hampei
  • Повторно инсталиране на разграждането на кофеин в H. hampei
  • Дискусия
  • Методи
  • Образци от насекоми
  • ДНК екстракция, PCR амплификация и последователност с висока производителност
  • 16S рРНК генен анализ
  • Изолиране на разграждащите кофеина бактерии и тяхното идентифициране.
  • Детекция на гени ndmA в изолирани и H. hampei
  • O 2 измервания с помощта на микроелектроди
  • Транзитно време на диета през H. hampei
  • Антибиотично лечение и реинфекция.
  • Откриване на кофеин в проби от фрас
  • Ефект на антибиотичното лечение върху репродукцията на H. hampei
  • Присъединяване
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Видеоклипове
  • Допълнителен филм 1
  • Excel файлове
  • Допълнителни данни 1
  • Коментари

Субекти

  • Ентомология
  • Микробна екология
  • Микробиом

Обобщение

Кафеното зърно (Hypothenemus hampei) е най-опустошителният вредител на кафе от насекоми в света, тъй като неговите нападения намаляват добивите с цели 80%. Кофеинът е алкалоид, който може да бъде токсичен за насекомите и трябва да действа като защитен механизъм за инхибиране на тревопасните. Тук показваме, че кофеинът се разгражда в червата на H. hampei и че експерименталното инактивиране на чревната микробиота елиминира тази активност. Демонстрираме, че чревната микробиота в екземпляри от H. hampei от седем страни производителки на кафе и колонии, отглеждани в лаборатории, споделят ядро ​​от микроорганизми. Глобално разпространените членове на чревната микробиота, включително известните видове Pseudomonas, издържат на кофеина като единствен източник на въглерод и азот. Гените на Pseudomonas кофеин деметилаза се експресират in vivo в червата на H. hampei, а възстановяването на насекомите, третирани с антибиотици с изолиран щам Pseudomonas, възстановява способността за разграждане на кофеина, потвърждавайки неговата ключова роля.

Въведение

При насекомите, както и при други животни, разграждането на кофеина може да се катализира от цитохром Р450 ензими 20, 21. Не се съобщава обаче, че други метазоани издържат на концентрациите на кофеин, на които е изложен H. hampei, като същевременно се издържат и завършват целия си жизнен цикъл изключително върху зелено кафе на зърна. Предполагаме, че разграждането на кофеина в H. hampei се осъществява предимно от активността на чревната му микробиота. Тук представяме първото изследване на микробиома на H. hampei и неговата роля в детоксикацията на кофеин в насекомото. Нашето откритие на компонент от микробиота за трансформирането на кофеина и съществуването на H. hampei в кафе на зърна има важни последици за разбирането на метаболизма и екологията на този важен вредител.

Резултати

Разграждането на кофеина при H. hampei

За да проверим хипотезата, че разграждането на кофеина е процес, медииран от микроби в H. hampei, взехме проби от седем географски разпръснати райони за отглеждане на кафе: Кения (Киамбу), Индонезия (Източна Ява), Индия (Карнатака), Пуерто Рико (Аджантас ), Хавай (Кона), Гватемала (Коатепеке) и Мексико (Чиапас). Екземплярите от Индия също включват проби от насекоми от двата доминиращи вида Coffea (C. arabica и C. canephora). В допълнение използвахме лабораторно отгледана колония, първоначално получена от колумбийска популация от H. hampei и три други вида корояди, които не могат да издържат на кафе на зърна (H. crudiae, H. eruditus и Scolytodes maurus).

Таблица в пълен размер

( да се ) Експериментално проектиране и анализ на концентрациите на кофеин в контролната проба и проби от H. Hampei, третирани с антибиотици. Антибиотично медиирано изчерпване на микробиома H. hampei елиминира трансформацията на кофеин и увеличава отделянето на кофеин. ( б ) FTIR профили за чист кофеин (черен), контролни екскременти (насекоми, които не са третирани с антибиотици, червени) и екскременти на насекоми, третирани с антибиотици (зелен). Представените профили представляват средната стойност на всички измервания (n = 6).

Изображение в пълен размер

Биогеографски анализ на микробиома на H. hampei

( да се ) Филогенетичен мрежов анализ, показващ доминиращите бактериални групи, свързани с проби от H. hampei от седемте основни страни производителки на кафе. Екземплярите от Мексико включват и насекоми, които не са от H. ◊, H. hampei, - S. maurus; Δ, H. crudiae; □, H. eruditus. ( б ) Пропорции на Pseudomonas spp. последователности в микробиома на събраните проби.

Изображение в пълен размер

Кофеин-разграждащи бактерии в червата на H. hampei

( да се ) Кофеинова градиентна плоча, представляваща бактериални колонии, изолирани от храносмилателния тракт на H. hampei и тяхната идентичност, определена чрез филогенетичен анализ. P. fulva е основната група получени изолати. ( б ) Филогенетично дърво за кофеиновата деметилаза алфа субединица (NdmA), получени от изолирани бактерии (жълто), а също и от РНК, извлечена от полеви проби от H. hampei (зелено). ( ° С ) Проби от H. hampei, предварително обработени с антибиотици в продължение на четири седмици, се инокулират с P. fulva, възстановявайки способността му да разгражда кофеина, както се демонстрира чрез измерване на кофеина FTIR и GC-MS в неговата утайка (вж. Таблица 1).

Изображение в пълен размер

Кислородни профили в червата на H. hampei

Кислородните градиенти се измерват в червата на H. hampei с помощта на микроелектроди. Всички измервания са направени в предната средна черва на бръмбара (вж. Допълнителна фигура 1). По време на тези процедури върхът на електрода се задвижва към повърхността на чревната стена и се задържа в положение, докато измерените концентрации на O2 се стабилизират. Във всички случаи, след като върхът проникне в чревната стена, концентрациите на кислород намаляват със стръмни градиенти, които преминават от микроаерофилни условия към намалено анаеробно ядро ​​(фиг. 4).

Фигурата показва кислородните профили на три черва на бръмбари. Обърнете внимание на прехода от микроаерофилен регион към анаеробно ядро ​​в лумена на предното средно черво (вж. Допълнителна фигура 1).

Изображение в пълен размер

Възстановяване на разграждането на кофеин в H. hampei

Лабораторните проби от H. Hampei, лекувани с антибиотици, първоначално са хранени с минимална диета, съдържаща P. fulva за 1 седмица. Впоследствие насекомите бяха прехвърлени на прясно приготвена стерилна минимална диета и им беше позволено да се хранят в продължение на 4 часа, преди да се събере количеството отпадъци и да се определят количествено концентрациите на кофеин. Анализите GC-MS и FTIR показват почти пълно изчерпване на съдържанието на кофеин в екскрементите на реинфектираните насекоми (фиг. 3в, таблица 1). Оценена е и репродуктивната годност на насекоми, лекувани с антибиотици и заразени с P. fulva. Насекомите не възвърнаха способността си да се размножават след инокулация с P. fulva (допълнителна фигура 3).

Дискусия

Въпреки че от време на време се съобщава, че други насекоми се хранят с кафеното семе 24, H. hampei, това е единственото насекомо, което се е специализирало в храненето и завършването на целия си жизнен цикъл изключително в рамките на кафените зърна в зрънцето 16, 25. Докато оцелява в тази среда, H. hampei изпитва хронично излагане на кофеин, за който е известно, че е токсичен алкалоид 3, 5, 7, 9, 10, което прави това насекомо привлекателна моделна система за оценка на ролята на микробите в адаптацията на животни в необичайна среда. В това проучване тествахме дали разграждането на кофеина в H. hampei се медиира от чревната микробиота на насекомото.

Членовете на чревната микробиота на H. Hampei са идентифицирани от насекоми, събрани от седем страни производители на кафе и една лабораторна колония. Изчислените анализи на разделяне на β разнообразие и вариация показват, че микробиомният състав на H. hampei е бил значително свързан с географския произход на кафето, а също и с видовете кафе, където варира (вж. Допълнителни данни 1). Образуването на морфокриптични единици по-рано е демонстрирано в проби от H. hampei, събрани от различни страни производители на кафе, чрез анализ на микросателитни маркери и COI 30 генни последователности. Тези съобщени „видови комплекси“, заедно с нашите констатации за географска вариация на микробни съобщества в H. hampei, може да са показателни за коеволюцията на насекомите и тяхната микробиота. Съдържанието на кофеин варира значително сред видовете кафе, оценени 31, и въпреки че не е тествано тук, концентрацията на кофеин може да бъде друг важен фактор, който оказва влияние върху състава на чревния микробиом на чревния H. hampei.

Тук показваме, че H. hampei, най-опустошителният вредител на кафе в страните производителки на кафе, притежава обща сърцевина на чревната микробиота, която се споделя между индивиди от различни географски местоположения и че много от тези организми могат да се издържат само от източник на кофеин. въглерод и азот. Ние също така демонстрираме, че микробиотата на H. hampei е отговорна за разграждането на кофеина в храносмилателния тракт на насекомото. Микробните общности играят важна роля във всички екосистеми, от участието в цикъла на хранителните вещества в почвата до конфигурацията на имунната система при хората 35, 36, 37. Нашата демонстрация на ролята на чревната микробиота за детоксикацията на кофеин при H. hampei има важни последици за разбирането на метаболизма и екологията на този важен вредител на кафето. Той също така предоставя нови пътища за разработване на стратегии за биоконтрол, където микробиомът представлява нова цел поради ролята на асоциираните микроорганизми в засилената способност на гостоприемника да оцелее и да доминира във враждебна среда.

Методи

Образци от насекоми

Проби от H. hampei (n = 68; допълнителни данни 1) са получени от Кения (Kiambu), Индонезия (Източна Ява), Индия (Карнатака), Пуерто Рико (Adjuntas), Хавай (Kona), Гватемала (Coatepeque) и Мексико (Чиапас; Допълнителни данни 1). Насекомите от Индия бяха събрани от C. arabica и здрав хибрид (C. congensis × C. canephora). H. obscurus, H. crudiae и S. maurus са получени от стъблата на листата Cecropia в Чиапас, Мексико. За целите на биогеографското проучване и сравнение бяха включени и сондачи за зрънце кафе, отглеждани на изкуствена диета 38 (лабораторни насекоми). На всички места за събиране отделни насекоми се поставят на живо в епруветки, съдържащи RNAlater (Ambion, Grand Island, NY, USA) и се изпращат в нашата лаборатория за анализ.

ДНК екстракция, PCR амплификация и последователност с висока производителност

16S рРНК генен анализ

Изолиране на разграждащите кофеина бактерии и тяхното идентифициране.

Откриване на гена ndmA в изолати и H. hampei

O 2 измервания с помощта на микроелектроди

Диетично транзитно време в H. hampei

Антибиотично лечение и реинфекция.

Откриване на кофеин в проби от фрас

Бяха спазени две стратегии за определяне на концентрацията на кофеин в проби от треска от лекувани с антибиотици, заразени с антибиотици и контролни бръмбари: измерване на кофеин в суров фрас с FTIR и измерване на кофеин, извлечен от проби от фрас с GC-MS .

За анализите FTIR и GC-MS бяха установени значителни разлики между леченията (контрол, третирани с антибиотици и третирани с антибиотици/повторно инокулирани) с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ и по-малко значими разлики с помощта на софтуерната среда R 53 .

Ефект от антибиотичното лечение върху репродукцията на H. hampei

Сто жени наскоро се появиха, когато възрастните бяха поставени заедно с 20 мъже във флакони, съдържащи редовна диета, и инкубирани в продължение на 14 дни, за да се максимизира чифтосването. След първоначалната инкубация на чифтосване, отделни женски са прехвърлени във флакон, съдържащ редовна диета (контрол) или диета, допълнена с антибиотик (както е описано по-горе) и инкубирани в продължение на 44 дни. Трета група от женски жени са третирани с антибиотици в продължение на 3 седмици, прехвърлени на диета с P. fulva и също инкубирани в продължение на 44 дни. Взети са разрушителни проби от петнадесет флакона от всяко третиране по всяко време за вземане на проби (дни 14, 24, 34 и 44) и са анализирани яйцата, ларвите, какавидите и възрастните. Извършена е логистична регресия върху сумата от всички етапи във всеки флакон. След това модел беше снабден само с основните ефекти (ДИЕТА: контрол, антибиотици, инфекция и ПРОБА: време за вземане на проби), където беше включено прекомерното разсейване. И двата основни ефекта са значителни, т.е. има значителен ефект на DIET в сравнение с контролата и има значителен ефект на пробата (следващите проби имат по-висок брой).