нова

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • ZooMS откриване на остатъци от хоминин
  • DC1227 Micro CT сканиране
  • Радиовъглероден анализ на DC1227
  • Митохондриална ДНК (mtDNA) последователности на проба DC1227
  • Заключения
  • Методи
  • ZooMS
  • Компютърна томография
  • Митохондриален ДНК анализ
  • Извличане на ДНК и подготовка на библиотека.
  • Митохондриално улавяне и секвениране
  • Обработка на последователности и картографиране
  • Филогенетичен анализ
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Excel файлове
  • Допълнителни данни 1
  • Коментари

Субекти

  • Археология
  • Масова спектрометрия

Обобщение

ДНК секвенирането революционизира нашето разбиране за архаични хора през средния и горния палеолит. За съжаление, докато много палеолитни обекти съдържат голям брой кости, повечето от тях нямат диагностичните характеристики, необходими за традиционната морфологична идентификация. В резултат на това възстановяването на човешки останки от плейстоцена е изключително рядко. За да избегнем този проблем, ние приложихме метод на колагенов пръстов отпечатък върху над 2000 фрагментирани кости от пещерата Денисова, Русия, за да улесним откриването на човешки останки. В резултат на нашия анализ беше идентифицирана единична хомининова кост (Денисова 11), подкрепена от задълбочен анализ на пептидно секвениране и бе установено, че носи митохондриална ДНК от неандерталски тип. Последващото радиовъглеродно датиране разкрива, че костта е на възраст над 50 000 години. Тук ние демонстрираме огромния потенциал, който отпечатъците от колаген имат за идентифициране на останките на хоминин в силно фрагментарни археологически сборища, увеличавайки наличните ресурси за по-широки изследвания върху човешката еволюция.

Въведение

Вкаменелостите на хоминините от пещерата Денисова се оказаха безценни в нашето разбиране за архаични популации от хоминини. Това се подчертава от изключителното състояние на запазване на древни ДНК молекули в някои от костите, възстановени на мястото. Денисованската фаланга (Денисова 3), например, съдържа> 70% ендогенна ДНК, произвеждаща геном с голямо покритие (30x) 7. Въпреки интензивните разкопки в Денисовата пещера, сред хилядите изкопани кости са установени само няколко останки от хоминин. Идентифицираните са зъби или малки размери, обикновено фаланги, които са по-малко склонни да страдат от фрагментация, водеща до загуба на диагностични характеристики. Подобна фрагментация, която се дължи както на екологичната тафономия, така и на месоядната или човешката дейност, води до висок процент на костите, изкопани от този и много други археологически обекти, които не могат да бъдат идентифицирани въз основа на тяхната морфология 3, 8. Само в Източната галерия на Денисовата пещера при разкопки между 2005 и 2013 г. са получени приблизително 135 600 кости; обаче 128 591 не могат да бъдат идентифицирани 8 .

Тук прилагаме метод за идентификация на видовете отпечатъци на колагенов пептид, известен като зооархеология чрез масова спектрометрия (ZooMS), към 2315 неидентифицируеми костни фрагмента, архивирани от пещерата Денисова. Тези недиагностични кости са избрани от материал, изкопан в Източната галерия на пещерата през 2014 г. Размерите на останките варират, обикновено между 3 и 5 см, с кости, които са били достатъчно големи, за да бъдат полезни за по-нататъшен анализ (т.е. т.е. радиовъглероден и ДНК анализ ) за предпочитане избран. В близкото минало анализът на ZooMS е успял да разграничи широк кръг от групи бозайници, включително опитомени таксони 9, 10, диви сухоземни таксони 11, 12 и морска фауна 13, както и някои таксони, които не са бозайници. 14. За да постигне това, ZooMS използва пръстови отпечатъци на пептиди, за да анализира доминиращия протеин в костите, колаген тип 1 (COL1), известен със своята дълготрайност, особено в по-студен климат. Методът е създал колагенови пръстови отпечатъци в проби, датиращи от

Резултати

ZooMS откриване на остатъци от хоминин

По-рано публикувани човешки маркери са обозначени с A - G. Всички номерирани пикове представляват потвърдени последователности, съответстващи на пептиди, наблюдавани в човешки колаген (с изключение на E, който е известен само по сходство с хомоложните маркери при други видове 9).

Изображение в пълен размер

Идентифицираният хоминин екземпляр, DC1227, е изкопан от квадрат A-2, слой 12 на Източната галерия. Преди вземане на проби костта тежи 1,68 g, с максимална дължина 24,7 mm и ширина 8,39 mm. За анализ на ZooMS са взети около 36 mg (фиг. 2). Костта изглежда доста незабележима, без никакви морфологични характеристики или доказателства за умишлена модификация, поради което тя лесно се пропуска при остеологичен анализ.

Изображение в пълен размер

DC1227 Micro CT сканиране

Преди провеждането на допълнителни деструктивни проби за анализ на въглеродни и митохондриални ДНК е извършена микрокомпютърна томография (микро-КТ). Предвид рядкостта на такова откритие, микро КТ се счита за подходящо за идентифициране на области, които са претърпели видима деградация и следователно трябва да се избягват при бъдещи анализи. Резултатите разкриха, че пробата е много плътна, без признаци на деградация на костите, въпреки поредица от диагенетични микропукнатини, които минават по нейната дължина. Три от тези субмикронни пукнатини се простират много близо една до друга през костта, но те не образуват цепнатина и не изглежда да са нарушили структурата на костта. Сканирането също така подчерта степента на киселинно ецване и вдлъбнатини върху повърхността на костите, което може да е резултат от преминаването през храносмилателната система на месоядно животно (фиг. 3). На мястото са идентифицирани редица хищници; Като се има предвид разпространението на хиените в Денисовата пещера, изглежда вероятно костта да е била ецвана през стомашните киселини на хиена 8, 20 .

Изображение в пълен размер

Радиовъглероден анализ на DC1227

57 000 години 21, 22. Ако DC1227 бъде намерен in situ, ще се очаква връщане на възраст над горната граница на радиовъглеродното датиране (> 50 000 години).

Радиовъглеродното датиране е извършено в Оксфордския радиоуглероден ускорител (ORAU), следвайки стандартни 23 процедури и протоколи, което дава оценка на възрастта> 49 900 години BP (OxA-32241), което показва, че костта е по-стара от максимално измеримата граница за радиовъглеродно датиране на костен колаген. Резултатът напълно съответства на изведената геоархеологическа възраст по отношение на стратиграфската последователност на мястото.

Изотопните измервания на въглерод и азот дават стойност на δ 13 С от -17,3 и стойност на δ 15 N от 16,4 ‰. Хоминините в региона обикновено връщат азотните изотопни стойности между 13-15 ‰, които са показани например сред неандерталците от пещерата Окладников 24. Повишените стойности на DC1227 могат да показват различни диетични отклонения, включително диета, богата на протеини, получени от организми с по-високо трофично ниво, като сладководни риби 25, 26. Необходими са повече изследвания, за да се поставят повишените изотопни стойности в подходящ контекст и това ще бъде докладвано в бъдеще. Такива изследвания на изотопния състав на хоминидите и свързаната с тях фауна на Денисова имат потенциала да разкрият важна информация за диетите на палеолитните хоминини, живеещи на Алтай, и в момента подобно разследване продължава в Оксфордския университет.

Митохондриална ДНК (mtDNA) последователности на проба DC1227

Извличаме ДНК от 30,9 mg костен прах от DC1227 27. Аликвотна част от екстракта се превръща в едноверижна ДНК библиотека 28, която се обогатява за хомининови митохондриални ДНК фрагменти, използвайки 29 човешки митохондриални сонди. Изолираните ДНК фрагменти бяха секвенирани и картографирани в ревизираната в Кеймбридж човешка митохондриална референтна последователност (rCRS). Общо идентифицирахме 282, 502 уникални mtDNA фрагмента, по-големи от 35 двойки основи (допълнителна таблица S1).

За да преценим дали някои от mtDNA фрагментите са от древен произход, се възползвахме от факта, че цитозиновите основи (C) в краищата на ДНК молекулите са склонни да се дезаминират с течение на времето 30 и като резултат се отчитат като тимин (T) ДНК полимерази. По-старите ДНК фрагменти, подравнени към референтна последователност, са склонни да носят високи честоти на очевидни заместители от С до Т в техните 5 'и 3' краища 31, 32, 33. От фрагментите, които започват или завършват в позиции, където основата на rCRS е C, 32,2% и 31,3% носят Ts съответно в техните 5 'и 3' краища (допълнителна фигура S13), което показва, че старите хомининови ДНК молекули присъстват в DC1227.

За да определим дали ендогенната mtDNA на DC1227 е по-тясно свързана с човешки, неандерталски или съвременни митохондриални геноми на Денисов, ограничихме анализа до последователности, които носят заместване С до Т спрямо rCRS в един от техните краища 34, за да се намали влиянието на настоящото предполагаемо замърсяване с човешка ДНК (допълнителна информация). Използвайки 36 665 такива последователности (допълнителна таблица S1), митохондриалният геном на образец DC1227 е реконструиран със средно покритие 130 пъти, оставяйки 63 позиции, покрити от две или по-малко последователности и четири, където по-малко от две трети от последователностите носят една и съща основа . Следователно 67 позиции не могат да бъдат извикани с увереност.

Когато сравняваме DC1227 mtDNA за завършване на неандерталската mtDNA, определена към днешна дата, тя има пет основни разлики с неандерталската mtDNA от Okladnikov 2 33, която е на около 60 км от пещерата Денисова, 12 до 17 разлики от неандерталците от Западна и Южна Европа и разлики с Мезмайская 1 от Кавказ 35 и неандерталец, открити в Денисовата пещера 5. За сравнение, mtDNA на DC1227 се различава между 174 и 354 основи по отношение на mtDNAs на други хомининови групи (допълнителна таблица S2). При филогенетичен анализ (фиг. 4) геномът на митохондриите DC1227 попада в диапазона от десет неандерталци, с изключение на 311 настоящи хора, десет древни съвременни хора, двама денисовани и един хоминин от средния плейстоцен на Испания. Заключваме, че отделен DC1227 носи митохондриален геном от неандерталски тип и го наричаме по-долу Денисова 11.

MtDNA на шимпанзе се използва като външна група (не е показана). Поддръжката за всеки клон се основава на 500 реплики за зареждане. Вижте Таблица S2 за географския произход на древни образци.

Изображение в пълен размер

Заключения

Методи

ZooMS

Между 20 и 50 mg кост се взема от всяка кост в комплекта и се деминерализира в 0,6 М солна киселина (НС1) в продължение на 18 часа. Полученият остатък се отстранява на ултрафилтри с прекъсване на молекулното тегло 30 kDa (MWCO) и се центрофугира при 3700 об/мин за 1 час. Филтратът се измива два пъти с 500 ul 50 mM амониев бикарбонат (AmBic) и се центрофугира при 3700 rpm в продължение на половин час след всяко третиране. Крайният остатък се ресуспендира с допълнителен AmBic (200 µL), половината от които се отстранява, за да се създаде резервен набор от проби преди разграждането. След това останалите 100 µL се третират с 0,2 µg трипсин (степен на секвениране; Promega UK) и се инкубират при 37 ° С в продължение на 18 часа. След това полученият разтвор се смесва с матричен разтвор от 1 μl разтвор на а-циано-4-хидроксикинамиева киселина (10 mg/ml в 50% ацетонитрил (ACN)/0,1% трифлуороцетна киселина (TFA)), оставен да се кристализира и се анализира с помощта на масспектрометър MALDI Tof/Tof Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Бремен). Получените мас спектри бяха избрани за човешки маркери 9, 12 в рамките на софтуера FlexAnalysis.

Компютърна томография

Компютърната томография беше извършена с помощта на микросканер Nikon XT H 225 с цел на предаване. Правени са опити да се поддържа дозата възможно най-ниска, за да се избегнат повреди на пробата, така че сканирането се извършва при 70kv и 80 μA. Общо бяха взети 1448 двукадрови проекта на прожекция, с експозиция, зададена на 100 ms и увеличение × 7,2. Данните бяха реконструирани със софтуера CT Pro 3D и обработени със софтуера VG Studio Max 2.1.

Митохондриален ДНК анализ

Извличане на ДНК и подготовка на библиотека.

30,9 mg костен прах бяха отстранени от DC1227 с помощта на зъбна бормашина. ДНК беше извлечена с помощта на протокол, базиран на силициев диоксид, предназначен за възстановяване на къси ДНК молекули 27, 36. 10 μl от ДНК екстракта (E3128) се превръщат в едноверижна ДНК библиотека (A9301), както е описано 28, 36. Броят на ДНК молекулите в библиотеката беше оценен чрез PCR с цифрови капчици (BioRad QX 200), като се използва 1 μl като вход за анализ EvaGreen (BioRad) с праймери IS7 и IS8 37. Библиотеката получи баркод с два уникални индекса 36,38 и беше усилена с помощта на AccuPrime Pfx ДНК полимераза (Life Technologies) 39. Продуктите за амплификация се пречистват с помощта на MinElute PCR пречистващ комплект (Qiagen); и се определя количествено в фотопектрометър NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Митохондриално улавяне и секвениране

Усилената библиотека (A9317) беше обогатена с протокол за улавяне на хибридизация на базата на микросфера 29, използвайки мозайка с единична двойка, проектирана 52 mer 40 сонди в rCRS (Национален център за биотехнологична информация [NCBI] справка NC_012920) в два кръга на улавяне, използвайки 1 μg и 0.5 μg входна ДНК, съответно. Заловената библиотека (L5502) е секвенирана на платформа MiSeq (Illumina), като се използват двойки прогони (2 × 76 цикъла) с конфигурация с двоен индекс 38. ДНК екстракционна заготовка и заготовка за библиотечна подготовка бяха проведени през цялата процедура като отрицателни контроли.

Обработка на последователности и картографиране

Базовият разговор беше осъществен с помощта на Bustard (Illumina). Последователностите на адаптера бяха изрязани и четенето напред и назад беше обединено в отделни последователности 41. Последователностите, на които липсваха перфектни съвпадения с очакваните баркодове, бяха изхвърлени. Картографирането към референтния геном се извършва с помощта на BWA 42, с параметрите "-n 0,01 -o 2 -l 16500" 7. PCR дубликатите бяха премахнати чрез сливане на последователности с еднакви начални и крайни координати на подравняване, като се използва bam-rmdup (//github.com/udo-stenzel/biohazard). За по-късен анализ бяха запазени последователности от над 35 бази с качество на картографиране над 30.

Филогенетичен анализ

За реконструиране на DC1227 mtDNA бяха използвани последователности, носещи терминал С до Т заместване. Терминали Ts в първата или последната позиция на всяка последователност бяха преобразувани в N, за да се намали въздействието на грешките, извлечени от последователността върху консенсусни повиквания. База за консенсус беше определена, ако дадена позиция беше покрита от поне три последователности и ако поне 67% от последователностите, т.е. повече от две трети припокриващи се, носеха идентична база 34 .

MtDNA се изравнява с mtDNAs на 311 съвременни хора 43, 10 древни съвременни хора 31, 44, 45, 46, 47 десет неандерталци 5, 33, 35, 48, 49, два Denisovans 3, 4 средно плейстоцен хоминин 34 и шимпанзе (Pan troglodytes, NC_001643) 50 от MAFFT 51. Броят на основните разлики между последователностите и дървото на Съседите на съседите с 500 реплики за зареждане 52 въз основа на тези разлики са получени с помощта на MEGA6 53 .

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Brown, S. et al. Идентифициране на нова хомининова кост от пещерата Денисова, Сибир, чрез използване на пръстови отпечатъци на колаген и анализ на ДНК на митохондриите. Sci. Rep. 6, 23559; doi: 10.1038/srep23559 (2016).

Код за достъп: последователността на митохондриалния геном на пробата DC1227 (Денисова 11) е депозирана в GenBank (номер за присъединяване KU131206).