с-тип

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Израз на мастна тъкан при затлъстяване.
  • Променено разпределение на липидите при мишки Минкъл KO
  • Подобрява метаболизма на глюкозата при мишки Минкъл KO
  • Намаляване на фиброзата на мастната тъкан при мишки Минкъл KO
  • Намаляване на образуването на CLS в мастната тъкан на мишки Минкъл KO
  • Фиброгенна генна експресия, стимулирана от mincle в макрофаги
  • Увеличение на миофибробластите, стимулирани от mincle в SVF
  • Стимулирана от Mincles интерстициална фиброза в мастната тъкан
  • Дискусия
  • Методи
  • Реактиви
  • Животни
  • Хистологичен анализ
  • Хибридизация в ако ти
  • Поточен цитометричен анализ.
  • Конфокален микроскопски анализ
  • Съдържание на колаген в мастната тъкан
  • Съдържание на триглицериди в черния дроб
  • Тестове за толерантност към глюкоза и инсулин
  • Уестърн блотинг на Akt
  • Анализ на серума
  • TDM стимулация
  • Количествена PCR в реално време
  • Анализ на микрочипове
  • BMT експерименти
  • статистически анализ
  • Допълнителна информация
  • Присъединяване
  • Омнибусна генна експресия
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

  • Моноцити и макрофаги
  • Затлъстяване
  • Патогенеза

Обобщение

Въведение

Като място на кръстосано препращане между адипоцитите и макрофагите, има уникална структура в затлъстелата мастна тъкан, наречена короновидна структура (CLS), където макрофагите се считат за отстраняване на остатъчни липидни капчици от мъртвите адипоцити 9, 10. Хистологично провъзпалителните M1 макрофаги се агрегират, за да съставят CLS в мастна тъкан на хора и гризачи. От друга страна, М2 макрофагите са разпръснати в интерстициалните пространства между адипоцитите 10. По-специално, броят на CLS корелира положително със системната инсулинова резистентност при затлъстели индивиди, 11, 12, което предполага патофизиологичната роля на CLS при възпаление на мастната тъкан и системния метаболизъм на енергия. Въпреки това, начинът, по който CLS се образува в мастната тъкан по време на затлъстяването и как участва в ремоделирането на мастната тъкан, е слабо разбран.

Индуцируемият от макрофаги лектин тип С (Mincle, Clec4e или Clecsf9) е патогенен сензор, който разпознава патогенни гъби и Mycobacterium tuberculosis 13, 14, 15, 16 и както подсказва името му, той се индуцира в макрофагите от липополизахарид a през Toll- като рецептор 4 (TLR4; справка 17). По-рано съобщавахме, че наситените мастни киселини също индуцират експресия на Mincle в макрофаги чрез TLR4 (реф. 18). Освен това, индуцираното от затлъстяването увеличение на експресията на Mincle в мастната тъкан е значително отслабено при мишки C3H/HeJ с дефектна TLR4 сигнализация спрямо контролните мишки C3H/HeN 18. Yamasaki et al. съобщава, че Mincle може също така да открие клетъчна смърт, за да индуцира провъзпалително производство на цитокини и предложи ролята на Mincle при стерилно възпаление 19. Наскоро показахме, че Mincle се индуцира в макрофагите на мастната тъкан по време на взаимодействието между адипоцитите и макрофагите, поне отчасти, чрез наситената мастна киселина/TLR4/NF-кВ път. Понастоящем не е ясно дали Mincle регулира възпалението на мастната тъкан и по този начин системния метаболизъм на енергията при затлъстяване и, ако е така, как се прави това остава да бъде изяснено.

Тук показваме, че Mincle, когато се индуцира по време на развитието на затлъстяване, се локализира в макрофаги, които представляват CLS в мастната тъкан. Интересното е, че мишките Mincle KO са защитени срещу образуване на CLS от затлъстяване и фиброза на мастната тъкан, последвано от по-малко натрупване на ектопични липиди и инсулинова резистентност в черния дроб. От друга страна, лечението с трехалоза-6,6'-димилат (TDM), гликолипид на микобактериалната клетъчна стена, за която е известно, че е лиганд на Mincle 13, индуцира образуването на CLS и интерстициална фиброза в мастната тъкан при мишки. . Стимулирането на Mincle също индуцира мощна експресия на свързани с фиброза гени в макрофаги in vitro. Това проучване предоставя доказателства, че Mincle има роля в кръстосаните препратки между адипоцитите и макрофагите в CLS, което води до активиране на фиброгенната програма. Нашите данни също така показват, че антагонизмът на Mincle в макрофагите предлага нова терапевтична стратегия за предотвратяване или лечение на индуцирана от затлъстяване фиброза на мастната тъкан и следователно натрупване на ектопични липиди.

Резултати

Изразяване на мастна тъкан при затлъстяване.

( да се ) Времеви ход на експресия на mRNA на Mincle и Emr1 (F4/80) в епидидимална мастна тъкан на мишки от див тип, хранени с HFD или SD за период до 50 седмици. Стойностите са средни ± sem. Данните се анализират чрез несдвоен t-тест; п = 5 до 11; † P †† P § P §§ P -, CD45 + CD11b - F4/80 - и CD45 + CD11b + F4/80 +, изолирани от SVF. Стойностите са средни ± sem; n = 4. ( и ) Процент на клетки, експресиращи Mincle в различни имунни клетки в SVF. Стойностите са средно за четири проби.

Изображение в пълен размер

Променено разпределение на липидите при мишки Mincle KO

( да се ) Телесно тегло и мазнини и чернодробно тегло на Mincle KO и мишки от див тип на 16 седмици. Стойностите са средни ± sem. Данните се анализират с помощта на дисперсионен анализ (ANOVA), последван от теста на Tukey-Kramer. ## P # P ## P ¶ P

( да се ) Илюстрация на TDM-стимулирани експерименти, използващи SVF. SVF, приготвен от ob/ob миши епидидимална мастна тъкан, се стимулира с TDM за до 3 дни. ( б ) Ефект на TDM стимулация върху експресията на Mincle mRNA, Tnfa, свързани с фиброза гени (Tgfb1, Pdgfb, Timp1) и Acta2. Стойностите са средни ± sem. Данните се анализират чрез несдвоен t-тест; n = 4, ** P-CD31 - в SVF, богат на фибробласти, приготвен от епидидимална мастна тъкан на ob/ob мишки, използвайки системата за сортиране на магнитни клетки (MACS). Клетките се стимулираха с TDM до 7 дни. ( д ) Ефект от стимулирането на TDM върху експресията на иРНК на Acta2 и Col1a1 (колаген I). Стойностите са средни ± sem. Данните се анализират чрез несдвоен t-тест; n = 4, ** P

Въз основа на нашите наблюдения, ние предположихме ролята на Mincle при възпаление на мастната тъкан при затлъстяване, както следва (Фиг. 8). По време на развитието на затлъстяване, експресията на Mincle се индуцира главно чрез TLR4 в инфилтрирани макрофаги, както се съобщава по-рано 18. Активиран от ендогенен лиганд, освободен от умиращите адипоцити, Mincle участва в агрегацията на макрофаги, за да образува CLS, където има трайно взаимодействие между адипоцитите и макрофагите. Активирането на Mincle също индуцира експресията на свързани с фиброза гени чрез Syk, което води до образуването на миофибробласти, вероятно чрез междуклетъчна комуникация между макрофаги и фибробласти. В резултат на това свръхпроизводството на ECM може да ограничи HFD-индуцираната хипертрофия на адипоцитите, която има роля в натрупването на липиди в черния дроб и непоносимостта към глюкоза.

По време на развитието на затлъстяване, експресията на Mincle се индуцира в инфилтрирани макрофаги и се активира от ендогенен лиганд, освободен от умиращите адипоцити. Mincle участва в агрегацията на макрофаги, за да образува CLS, а активацията на Mincle също индуцира експресията на свързани с фиброза гени, което води до образуването на миофибробласти. В резултат на това свръхпроизводството на ECM може да ограничи индуцираната от HFD хипертрофия на адипоцитите, която има роля в натрупването на липиди в черния дроб и непоносимостта към глюкоза.

Изображение в пълен размер

В обобщение, ние демонстрираме в това проучване, че Mincle има критична роля в HFD-индуцираното образуване на CLS и фиброзата на мастната тъкан, което може да намали капацитета за съхранение на липиди в мастната тъкан и да засили ектопичното натрупване на липиди. Нашите данни също така предполагат, че Mincle в макрофагите ще бъде нова терапевтична цел за предотвратяване или лечение на предизвикано от затлъстяване възпаление на мастната тъкан и метаболитно разстройство.

Методи

Реактиви

Всички реактиви са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури) или Nacalai Tesque (Киото, Япония), освен ако не е посочено друго.

Животни

Хистологичен анализ

In situ хибридизация

In situ хибридизация за Mincle тРНК е извършена, както е съобщено 42. Вградените в парафин тъканни блокове от епидидимална мастна тъкан се разделят на 8 μm. Срезите бяха фиксирани с 4% параформалдехид в продължение на 15 минути, третирани с 8 μg ml -1 протеиназа К в продължение на 30 минути при 37 ° С, отново фиксирани с 4% параформалдехид и след това ацетилирани с 0.25% оцетен анхидрид за 10 минути. Хибридизацията се извършва с сонди при концентрации от 300 ng ml -1 при 60 ° С в продължение на 16 часа. След хибридизация срезовете се промиват с 5 × физиологичен разтвор на натриев цитрат (SSC) при 60 ° С за 20 минути и след това с 50% формамид и 2 × SSC при 60 ° С за 20 минути, последвано от обработка с 50 μg ml -1 RNaseA за 30 минути при 37 ° C. След като срезите бяха измити допълнително няколко пъти с 2 × SSC и 0,2 × SSC, те бяха инкубирани с анти-DIG AP конюгат (Roche) за 1 h при стайна температура. След измиване два пъти, оцветяващите реакции се провеждат с разтвор на NBT/BCIP (Roche) за една нощ. Няколко секции бяха двойно оцветени с маркер за макрофаги, Iba1.

Поточен цитометричен анализ.

Провежда се цитометричен анализ на SVF, както е описано 43, 44. Накратко, епидидималната мастна тъкан се събира и нарязва на малки парченца и се инкубира в продължение на 20 минути в колагеназен разтвор (2 mg ml -1 колагеназа тип 2 (Worthington, Lakewood, NJ)) с леко разклащане. След филтриране през 180-μm отвор, ние го центрофугирахме и ресуспендирахме във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Промихме отделената SVF два пъти с PBS, инкубирахме ги в продължение на 10 минути в буфер за лизиране на еритроцити и го филтрувахме през 70-μm мрежа. Клетките бяха сортирани с помощта на FACSAriaII (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) и използвани за анализ на експресия на иРНК. Клетки, експресиращи пръсти, бяха анализирани с помощта на FACSCantoII (BD Biosciences) и FlowJo 7.2.2. софтуер (Tomy Digital Biology, Токио, Япония). Клетки, експресиращи Mincle, бяха идентифицирани с анти-Mincle антитяло (клон 4A9; MBL, Nagoya, Япония), белязано с Lightning-Link Atto-488 (Innova Biosciences, Cambridge, UK). Други антитела, използвани при поточно-цитометрични анализи, са изброени в допълнителна таблица 3.

Конфокален микроскопски анализ

За конфокален микроскопски анализ изолирани парчета тъкан бяха фиксирани в 4% формалдехид и проникнати с 0,5% Triton X-100. След това пробите бяха блокирани с 1% BSA и инкубирани с двойка първични антитела и след това със съответните вторични антитела. Оцветяванията бяха изследвани с помощта на системата за конфокален микроскоп FluoView FV10i (Olympus, Токио, Япония).

Съдържание на колаген в мастната тъкан

Общото съдържание на колаген в мастната тъкан се измерва с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (анализът на общия колаген QuickZyme; QuickZyme Biosciences, Лайден, Холандия).

Съдържание на триглицериди в черния дроб

Общите липиди в черния дроб бяха извлечени с помощта на ледено студен хлороформ и метанол, 2: 1 (v/v). Съдържанието на триглицериди в съдържанието на черния дроб беше измерено с помощта на набор за ензимен анализ (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).

Тестове за толерантност към глюкоза и инсулин

Тестът за толерантност към глюкоза е извършен след 18-часов пост. Концентрациите на кръвната глюкоза се измерват на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след интраперитонеално инжектиране на глюкоза (2 g kg -1 телесно тегло) чрез измервател на кръвна захар (Glutest PRO R; Sanwa-Kagaku, Nagoya, Япония ). За тест за толерантност към инсулин, инсулин (0,5 U kg -1 телесно тегло Humulin R-Insulin; Eli Lilly, Indianapolis, IN) се инжектира интраперитонеално след 1-часов пост. Концентрациите на кръвната глюкоза се измерват 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектирането.

Уестърн блотинг на Akt

Уестърн блотинг се извършва, както е описано 45. Накратко, мишки с лишаване от храна в продължение на 16 часа се инжектират с инсулин (0,5 U kg -1 телесно тегло Humulin R-инсулин; Eli Lilly) или PBS през посткавалната вена. Черният дроб, мускулът на солеуса и епидидималната мастна тъкан бяха отстранени съответно 1, 2 и 3 минути след инжектирането. Имуноблотирането се извършва с използване на анти-фосфо-Akt (Thr308) антитяло (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) и анти-Akt антитяло (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Имуноблот изображенията са количествено определени с помощта на ImageQuant LAS 4000 mini (Fujifilm, Токио, Япония). Представителни неразрязани петна са показани на допълнителна фигура 10.

Анализ на серума

Серумните FFA и ALT и концентрациите на инсулин се измерват с помощта на стандартен ензимен анализ или наличен в търговската мрежа ензимно-свързан имуносорбентен тест.

TDM стимулация

За стимулиране на перитонеални макрофаги или SVF, предизвикани от тиогликолат, от епидидимална мастна тъкан на ob/ob мишки, TDM, разтворени в хлороформ при 1 mg ml -1, се разреждат в изопропанол и се добавят върху 12- или 48-ямкови културални плаки (5 или 1,25 μg от TDM на гнездо, съответно), последвано от изпаряване на разтворителя, както е описано 13, 46. В някои експерименти перитонеалните макрофаги се култивират съвместно с фибробласти на мастната тъкан (CD45 - CD31 - клетки, приготвени от SVF на ob/ob мишки, използвайки системата за сортиране на магнитни клетки (MACS; Miltenyi Biotec, Auburn, CA)). За експерименти in vivo емулсията, съдържаща TDM (10 μg; реф. 13), се инжектира директно в епидидималната мастна тъкан. Три, пет и седем дни след инжектирането, епидидималната мастна тъкан беше събрана и подложена на анализ на генната експресия и трихромни и имунофлуоресцентни оцветявания на Masson.

Количествена PCR в реално време

Количествената PCR в реално време се извършва, както е описано 18. Накратко, общата РНК беше извлечена от тъканите или култивираните клетки с помощта на реагент Sepasol и 10 ng cDNA бяха използвани за PCR усилване в реално време с протокол за откриване на SYBR GREEN в термичен циклер (StepOne Plus, Applied Biosystems, Foster City, CA) . Праймерите, използвани в това проучване, са изброени в допълнителна таблица 4. Данните са нормализирани до нивата 36B4 и са анализирани с помощта на сравнителния CT метод.

Анализ на микрочипове

Анализът на микрочипове беше извършен с помощта на Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrays в съответствие с инструкциите на производителя. Нормализирането на данните за генната експресия беше обработено с помощта на алгоритмите Affymetrix Microarray Analysis Suite 5.0 (MAS5). Диференциално експресирани гени бяха избрани с промяна в пъти и стойността на Р (промяна в пъти> 2, Р 39. Накратко, клетките на костния мозък, получени от мишки Mincle KO- Egfp Tg и мишки Egfp Tg бяха промити три пъти със студен PBS и инжектирани интравенозно (1.8 × 10 6 клетки) в 7,5 Gy облъчени 8-седмични мъжки реципиентни мишки от див тип. След 4 седмици скоростта на заместване на клетките на костния мозък се определя чрез преброяване на EGFP-положителни клетки в периферната кръв и след това мишките се хранят до HFD за 16 седмици.