Обобщение

Този протокол позволява на изследователя да изолира и характеризира резидентната макрофагална тъкан в различни възпалени тъкани на тюлени, извлечени от индуцирани от диета модели на метаболитни нарушения.

Резюме

Въведение

Модели на мишки са използвани за изследване на динамиката на човешките заболявания. Правилната изолация на резидентни клетки от тъканта на мишки в болно състояние може да осигури платформа за разбиране на молекулярния и клетъчния принос към патогенезата на заболяването Едно разстройство, което е от жизненоважно значение, е затлъстяването. Честотата на затлъстяването продължава да се увеличава в световен мащаб, паралелно с инсулиновата резистентност и захарен диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания и мастни чернодробни заболявания 2, 3. Прекомерната консумация на хранителни вещества е по-пристрастна от намаляването на физическата активност, причиняващо променени сигнали от мастната тъкан, което може да промени клетъчната среда на други периферни тъкани като черния дроб и аортата 4. Такова нарушаване на метаболитната хомеостаза води до хронично нискостепенно системно възпаление на 5 .

Класическото активиране на резидента на аортата и черния дроб, както и набирането им в макрофаги бяла мастна тъкан (WAT), е показано не само да инициира дисрегулация на метаболитните сигнали, но и да поддържа възпаление 6, 7. Фенотипната и функционална хетерогенност на макрофагите е силно свързана с патогенезата на затлъстяването, свързана със съпътстващите заболявания. Динамичната пластичност на поляризацията на макрофагите позволява на тези клетки да проявяват разнообразие от активирани фенотипове, които координират прогресията и разрешаването на възпалението. Докато класически активираните макрофаги (М1) участват в разпространението на възпалението, алтернативно активираните макрофаги (М2) са свързани с разрешаване и възстановяване на тъканите 9, 10 .

Докато тялото претърпява метаболитен стрес, бялата мастна тъкан се натрупва необичайно. Разширената мастна тъкан привлича и задържа възпалителни клетки, които дълбоко променят нормалната функция на адипоцитите, за да насърчат инсулиновата резистентност, хипергликемия и захарен диабет тип 2, в крайна сметка инсулинова резистентност или хипергликемия 11, 12. Успоредно с това, ремоделиране на бяла мастна тъкан в отговор на възпалителни сигнали чрез инфилтриране на класически активирани макрофаги (АТМ) на мастна тъкан (M1) от 13, 14. Този многоклетъчен орган упражнява каскада от сигнали, които нарушават нормалната функция на други органи на тялото като аортата и черния дроб 4 .

Черният дроб е метаболитна електроцентрала, която се адаптира в отговор на дразнители от строго нерегулиран WAT 15. Чернодробните макрофаги или Kupffer клетки, в отговор на метаболитните промени, отделят възпалителни цитокини, които трансформират както паренхима, така и непаренхимния клетъчен фенотип и насърчават ремоделирането на тъканите. Натрупването на чернодробни липиди, възпаление, прекомерни отлагания на извънклетъчен матрикс, некроза и евентуална загуба на функция следват възпалителни обиди, допринасящи за широкия спектър от увреждания на черния дроб, свързани с неалкохолна мастна чернодробна болест .

Успоредно с нарушената WAT и чернодробната функция, големите артерии натрупват липиди в артериалната стена, докато тялото претърпява хроничен метаболитен стрес 19. Артериалното натрупване на липиди задейства секрецията на хемокин от активирани ендотелни клетки и последващо набиране на моноцити 20. Веднъж наети, моноцитите се размножават, диференцират, поглъщат липопротеини и се превръщат в пенообразни клетки. Атерогенезата се инициира и поддържа от провъзпалителната активност на вербувани и натоварени с липиди макрофаги, пребиваващи в тъканите. Поддавайки се на извънклетъчни и вътреклетъчни стресови сигнали, предадени в тази атерогенна микросреда, тези макрофаги след това участват в сигнална каскада за апоптоза. Тъй като тези пенообразни клетки умират, те допринасят за тяхното съдържание на липиди, което запълва некротичната основа на лезията, което след това води до разкъсване на плаката, инфаркт на миокарда и инсулт.

Колективно хетерогенността на фенотипите на макрофагите частично организира затлъстяването, предизвикано от възпалителни промени в нормалните тъкани като WAT, черния дроб и аортата 8, 21. Характеризирането на вербувани и резидентни макрофаги може да даде представа за потенциалните молекулни цели, които манипулират фенотип 1 на макрофагите. За да се характеризират ефективно макрофагите в индуцирани от затлъстяването възпалени тъкани, чрез клетъчно разлагане може да се получи едноклетъчна суспензия. Такива протоколи за дисоциация трябва да бъдат ефективни при достатъчно разграждане на съединителната тъкан, като същевременно минимизират имунната клетъчна смърт и осигуряват оптимално клетъчно представяне. Ензимната смес зависи от вида на тъканта и нейния структурен състав. Устойчивите тъкани като аортата изискват по-висока ензимна активност в сравнение с черния дроб и WAT, за да се постигне дисоциация на тъканите. От клетъчната суспензия резидентните макрофаги могат да бъдат еднозначно характеризирани или изолирани за по-нататъшен анализ надолу по веригата, като транскрипционно профилиране.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички експериментални протоколи (раздели 1, 1.2 и 1.3) бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC), Пенсилвански държавен университет.

Тъкани Приготвяне на дисоциационни буфери Краен обем Съхранение на информация
Бяла мастна тъкан (WAT) Буфер за отделяне: 2,5% HEPES, 10 mg/ml говежди серумен албумин (BSA), 3 mg/ml (0,3%) колагеназа тип II в модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM) с 4,5 g/L глюкоза без L-глутамин и натриев пируват 500 мл минус 80 ° C (10 ml аликвотни части)
Черен дроб 25 х инфузионен буферен концентрат (PBC): 3,55 M NaCl, KCl, 168 mM 240 mM HEPES, 150 mM NaOH в дестилирана дейонизирана вода H2O 500 мл минус 20 ° C (40 ml аликвотни части)
Решение за консервация (PRB): 1% BSA 1 x перфузионен буфер 1 л 4 ° С
Буфер за отделяне: 1 x перфузионен буфер, допълнен с 4,76 mM CaCl2 и 72 U/ml колагеназа тип IV 50 ml (на мишка) Пригответе непосредствено преди употреба
Аорта Буфер за отделяне: 125 U/ml колагеназа тип XI, 60 U/ml хиалуронидаза тип I, 60 U/ml DNase I, 450 U/ml колагеназа тип I, 20 mM HEPES 1 x физиологичен разтвор на фосфатен буфер (PBS) 500 мл минус 80 ° C (10 ml аликвотни части)

Таблица 1: Специфични рецепти за буфер на перфузионни тъкани.

1. дисоциация и изолация на тъканите

2. Поток на цитометрия и FACS оцветяване

Флуорофор R-фикоеритрин (PE) PE/цианин (Cy) 7 PE/цианин (Cy) 5 Тихоокеанско синьо (PB)
Лазер (nm) Синьо (488 nm)/жълто (561-570 nm) - зелено (532 nm) Синьо (488 nm)/жълто (561-570 nm) - зелено (532 nm) Синьо (488 nm)/жълто (561-570 nm) - зелено (532 nm) Виолетово (405 nm)
Максимално възбуждане (nm) 496 496 496 401
Максимална емисия (nm) 578 785 667 455
Фенотипен маркер F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX интегрин, интегрин αX верига, CR4, p150, ITGAX ΑM интегрин, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, ACV
Специфичен тип клетка Резидентни макрофаги Класически активирани макрофаги (M1) Моноцити/макрофаги Левкоцити (макрофаги/моноцити, лимфоцити и гранулоцити)
Подмножество на дендритни клетки Дендритни клетки, NK клетки, активирани Т клетки и подгрупа от чревни интраепителни лимфоцити (IEL) Гранулоцити, дендритни клетки, NK клетки и подгрупи на Т и В клетки
Коефициент на разреждане 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Изотипов контрол PE плъх IgG2a PE/Cy7 арменски хамстер IgG PE/Cy5 IgG2b от плъх Тихоокеански синьо плъх IgG2c

Таблица 2: Списък на маркирани с флуорофор специфични антитела за дискриминация на резидентни макрофаги.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Когато се използват мишки с дефицит на аполипопротеин Е (KO ApoE) C57BL/6 (BL6), държани на диета с високо съдържание на мазнини с висок холестерол (HCHFD или HCD) в продължение на 18 седмици, 1 x 10 4 - 2 x 10 4 CD45 + + на аортна F4/80 макрофагите могат да бъдат изолирани, когато двете проби се обединят. Дисектиран черен дроб от мишки, хранени с HFHCD KO ApoE, произвежда повече от 5 х 10 5 сортирани клетки на Купфер (което зависи от времето за сортиране). Когато използвам диета с високо съдържание на мазнини (HFD), хранена с див тип (WT) мишки C57BL/6, 5 x 10 5 до 1 x 10 6 мастна тъкан, пребиваваща в макрофаги, може да бъде поръчана от стромалната съдова фракция (SVF). Гореспоменатият брой макрофаги, които могат да бъдат поръчани от дадена тъкан, беше подходящ за анализ на количествената количествена полимеразна верижна реакция (qPCR) на генната експресия. За тъкани, при които се възстановява по-малко от популацията на макрофаги, като аортата, се препоръчва да се използват утаители Co (например гликоген) и утаяване през нощта, когато за тези анализи е необходимо изолиране на РНК.

характеризиране

Фигура 2: Профил на генна транскрипция на сортирани популации от клетки на Kupffer от дисектиран усвоен черен дроб на KO ApoE мишки, поддържани в HCD в продължение на 18 седмици. (ДА СЕ) Общи схемни блокове за характеризиране и класифициране на популациите на Kupffer клетки. (Б.) Анализ на генна експресия на експресиращ Ron (Ron +) и неекспресиращ (Ron -) CD45 ++ на F4/80 макрофаги чрез количествена RT PCR. Анализите на студентски t-тест бяха извършени с помощта на статистически софтуер и стойностите са представени като средна стойност ± SEM. Р 31. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 3: Характеризиране на ATM, изолиран от дисектирана бяла мастна тъкан от WT BL6 мишки, хранени с HFD в продължение на 18 седмици. Обща блокова схема (ДА СЕ), за да се характеризират и класифицират мастните тъкани, получени от популации на макрофаги (Б.) Процент на Ron + клетки в CD45 + + CD11c от F4/80 - и CD45 + + CD11c от F4/80 + популациите на макрофаги, сортирани от WAT. Фигурата е модифицирана от Yu et al. (2016) 31. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите нямат конфликт на интереси за разкриване.