ИЗСЛЕДВАНЕ НА КОМБИНИРАНАТА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОКРАТОКСИН А В IN VITRO И В VIVO МОДЕЛИ КОМБИНИРАНА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОХРАТОКСИН А В ВИТРО И В ВИВО МОДЕЛИ Laura Ana Corcuera Martínez DOCTORAL

комбинирана

Изследователската работа, озаглавена: ИЗСЛЕДВАНЕ НА КОМБИНИРАНАТА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОКРАТОКСИН А В IN VITRO И В VIVO МОДЕЛИ КОМБИНИРАНА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОХРАТОКСИН А В ВИТРО И В ВИВО МОДЕЛИ, представена от г-жа Laura Ana Corcuepira като г-жа Laura Ana Corcuepira като г-жа Laura Ana Corcuera Martine Университета в Навара, е осъществен в Департамента по хранителни науки, физиология и токсикология под ръководството на д-р Адела Лопес де Серен Салсаменди и съвместното ръководство на д-р Елена Гонсалес-Пеньяс Памплона, април 2012 г. Адела Лопес де Cerain Salsamendi Dra. Елена González-Peñas

Тази работа е финансирана от проектите: Микотоксини: токсичност на комбинираното лечение на охратоксин А и афлатоксин В1 в модели in vitro и in vivo Министерство на науката и иновациите на правителството на Испания Справка: AGL2008-01437/ALI Наличие на токсини в храната и нейното участие в човешкото здраве CAN Foundation Справка: 10829

На моето семейство от Памплона, Бегоня, Мигел, Ландър, Хавиер, Хосе, Асиер, Тхикитин, Мария, Маноло. че ме посрещна с толкова обич и ме накара да се почувствам като у дома си. На Ибан, за това, че предприема всяка стъпка с мен по този път, за ставането, когато падна и за вашето търпение. Благодаря ти, че ме обичаш толкова много и ме разбираш толкова добре. Тази теза също е ваша и бъдещето е наше. На семейството ми, че се грижи за мен. Ама, баба и дядо, които видяха началото и от небето виждат края. Ал Яйо, който може да се наслади на този триумф с мен. На чичо ми Игнасио и Бегоня, на Мария. На брат ми Луис, благодаря ви за насърчението, любопитството и възхищението ви, карате ме да искам да бъда по-добър всеки ден. Нищо не би било възможно без родителите ми, стълбовете на живота ми. Благодаря ви, че ме научихте, че добре свършената работа е самият успех. Благодаря ви за вашата любов, че вярвате в мен и ми дадохте да разбера, че мога. Това е и вашата награда. БЛАГОДАРЯ НА ВСИЧКИ! 9

Моите родители А Ибан Получиха го, защото не знаеха, че е невъзможно Жан Кокто

Съкращения/Съкращения Съкращенията/СЪКРАЩЕНИЯ 3-ADON: 3-ацетилдеоксиниваленол/3-ацетилдеоксиниваленол 8-оксо-ГД: 8-oxoguanine/8-oxoguanine 15 ADON: 15 ацетилдеоксиниваленол/15 ацетилдеоксиниваленол/Afto-B-ацетилдеоксиниваленол AF1Bto1xy1nivalenol AF1 FAPY: AFB1-формамидопиримидин/AFB1-формамидопиримидин AFB2: Афлатоксин B2/Афлатоксин B2 AFBO: AFB1-екзо-8,9-епоксид/AFB1-екзо-8,9-епоксид AFG1: Афлатоксин G1/Афлатоксин G1 AFG2: AftoG G1 AFG2 G2 AEFI: Испанска асоциация на фармацевтичните продукти в индустрията AOAC: Международна асоциация на химическите анализатори/Асоциация на официалните аналитични химици Сайт на AP: Apirimidinic или apurinic site AU: Произволни единици bw: Телесно тегло CIT: Citrinina/Citrinin CV: Коефициент на вариация DCFH- DA: Дихидрохлорфлуоресцеин диацетат/Дихидрохлорфлуоресцеин диацетат DL 50: Смъртоносна доза 50 DON: Дезоксиниваленол/Дезоксиниваленол DTI: Дневен приемлив прием ЕО: ​​Европейска комисия/Европейска комисия EFSA: Европейски орган за безопасност Alimentaria/Европейски орган за безопасност на храните 13

Съкращения/Съкращения OECD: Организация за икономическо сътрудничество и развитие/Организация за икономическо сътрудничество и развитие OTA: Охратоксин A/Охратоксин A PBS: Фосфатен буфер/Буфериран с фосфат физиологичен разтвор бр: Телесно тегло PECE: Обогатен с полифенол какао екстракт/полифенол обогатен екстракт от какао pk a: Константа на дисоциация на киселината RE: Относителна грешка SCF: Научен комитет по храните към Европейската комисия/Научен комитет по храните SCOOP: Научно сътрудничество по хранителни въпроси/Научно сътрудничество по въпроси, свързани с храните) RF: Относителна флуоресценция ROS: Реактивни кислородни видове/Реактивни кислородни видове RSD: Стандартно отклонение/Относително стандартно отклонение SE: Стандартна грешка t 1/2: Елиминационен полуживот/Елиминационен полуживот T-2: Токсин T-2/T-2 токсин TWI: Поносим седмичен прием UA: Произволни единици UHPLC-LD: Течна хроматография с ултрависоко съотношение разтвор с ултравиолетов детектор/ултра високоефективна течна хроматография-флуоресцентен детектор UV: ултравиолетов детектор СЗО: Световна здравна организация/Световна здравна организация ZEA: Zearalenone/Zearalenone 15

СЪДЪРЖАНИЕ/СЪДЪРЖАНИЕ Глава 1/Глава 1 Общо/общо въведение Въведение 17 Глава 2 Цел, цели и очертания 55 Глава 3 Охратоксин А намалява индуцираното от афлатоксин В1 увреждане на ДНК, открито от анализа на кометата в Hep G2 клетки 61 Глава 4 Обогатен с полифенол какаов екстракт намалява свободните радикали, произведени от микотоксини 85 Глава 5 Валидиране на аналитичен метод на UHPLC-FLD за едновременно количествено определяне на афлатоксин В1 и охратоксин А в плазмата на плъхове, черния дроб и бъбреците 109 Глава 6 Подход към токсичността и токсикокинетиката на афлатоксин В1 и охратоксин А след едновременно перорално приложение на плъхове F344 135 Глава 7 Охратоксин А намалява генотоксичността на афлатоксин В1: Едновременно прилагане на in vivo микроядра и анализ на комети 159 Глава 8 Обща дискусия 187 Глава 9/Глава 9 Заключения/Заключения 207 17

Глава 1/Глава 1 Общо въведение/Общо въведение

Глава 1/Глава 1 AFLATOXIN B1 Химични свойства AFB1 принадлежи към семейството на дифуран кумарин. Систематичната му номенклатура е 2,3,6aα, 9aα-тетрахидро-4-метоксициклопента [c] -b-фуро [2 ', 3': 4,5] фуро [2,3-h] хромен-1,11-дион, C 17H 12O 6 е неговата молекулна формула е и теглото му е 312.27 g/mol. Незначителните вариации в неговата химическа структура пораждат набора от афлатоксини, които могат да бъдат намерени в природата (AFB1, AFB2, AFG1 и AFG2). AFB1 е този с най-висока концентрация, последван от AFG1, AFB2 и AFG2. Редът, който тези вещества следват по отношение на тяхната остра и хронична токсичност, е AFB1> AFG1> AFB2> AFG2 и е пряко свързан със способността да образуват епоксид при двойна връзка 8-9 (маркирана с червена стрелка на фигурата) и потентността, свързана с циклопентеноновите пръстени (синя стрелка) (McLean and Dutton, 1995). Афлатоксини М1 и М2 са продукти на хидроксилиране на окислителния метаболизъм на афлатоксини В1 и В2, съответно. Фигура 1: Афлатоксини, присъстващи в природата (EFSA, 2007) 24

Общо въведение/Общо въведение, предизвикващо образуването на 8-OHdG в черния дроб на плъх и патица. Това увреждане на ДНК може да предизвика G> T трансверсия, което би довело до принос за канцерогенността на AFB1 (Bedard and Massey, 2006). Фигура 4: Еволюция на адукта AFB1-DNA (Smela et al., 2002) 31

Глава 1/Глава 1, че OTA във фенолната си форма (OTA -) се превръща във феноксониев катион (фигура 8, J), който от своя страна се трансформира в OTAQ (фигура 8, K) (Ringot et al., 2006; Dai et ал., 2002). От друга страна, многократното приложение на OTA може значително да намали нивата на вътреклетъчните антиоксиданти като глутатион (GSH), супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) или глутатион пероксидаза (GSPx) в черния дроб и бъбреците (Meki и Hussein, 2001) и увеличаване на липидната пероксидация (Khan et al., 1989). Изследванията на структурна активност предполагат, че хлорният атом е от съществено значение за генотоксичния ефект на OTA, тъй като хлорираните съединения, които предизвикват увреждане на ДНК, предварително преминават процес на биоактивиране на бензохинони (Ringot et al., 2006). Фигура 8: Образуване на ROS от OTA (Ringot et al., 2006) Проучванията на генната експресия показват, че OTA е способен да намали експресията на гени, участващи във вътреклетъчната окислителна защита, по-интензивно в черния дроб, отколкото в бъбреците (Cavin et al., 2007; Arbillaga et al., 2008); и това увеличава експресията на азотен оксид синтетаза 40

Общо въведение/Общо въвеждане индуцируем (inos), ензим, отговорен за производството на азотен оксид (NO). NO може да реагира с O 2- и да генерира пероксинитрити, които се развиват в реактивни азотни видове (RNS), които реагират с ДНК и протеини (Marin Kuan et al., 2011). Наличната информация предполага, че ОТА е малко вероятно да действа чрез един механизъм на действие. OTA, особено в бъбреците, генерира оксидативен стрес директно (генериране на радикали, които променят редокс циклите) и индиректно (намаляване на антиоксидантната защита). И двата механизма могат да си взаимодействат, тъй като намаляването на защитните сили усилва въздействието на производството на свободни радикали (Marin Kuan et al., 2011). Следователно, механизмът на действие, предложен като отговорен за канцерогенността на OTA, би бил мрежа от взаимодействия на епигенетични механизми, включително инхибиране на протеиновия синтез, оксидативен стрес и активиране на определени клетъчни сигнални пътища (Marin Kuan et al., 2008 ). 41

Глава 1/Глава 1 слоеве, по-ниски количества AFB1 и OTA се наблюдават в гърдите, черния дроб и бъбреците, както и в снасените яйца (Zahoor Ul Hassan et al., 2011). Съществуващите данни показват, че адекватните проучвания за установяване на антагонизми, синергии и адитивни ефекти са редки и трудни за интерпретация. Като отправна точка може да се направи опит да се разбере комбинираната токсичност на микотоксините въз основа на техния индивидуален механизъм на действие в клетката. По този начин при микотоксини с подобни начини на действие могат да се очакват адитивни ефекти или дори някои взаимодействия могат да бъдат антагонистични (Speijers, 2004). В случая на AFB1 и OTA механизмите на действие са много различни, но и двата започват в биотрансформацията в цитохром P450, така че може да възникне всякакъв вид асоциация. На практика полученият количествен или качествен резултат може да бъде много различен от очаквания и, както беше прегледано, AFB1 и OTA могат да дадат всякакъв вид взаимодействие между тях in vitro и in vivo. Резултатът изглежда зависи от проведеното проучване на вида или токсичността или дори от вида на използваната крайна точка. 44

Глава 1/Глава 1 СЗО, 2001. Оценка на безопасността на някои микотоксини в храната. Серии на хранителните добавки на СЗО 47. Wild, C. and Gong, Y., 2010. Микотоксини и човешки заболявания: до голяма степен пренебрегван глобален здравен проблем. Карциногенеза 31, 71-82. Williams, J.H., Phillips, T.D., Jolly, P.E., Stiles, J.K., Jolly, C.M. и Aggarwal, D., 2004. Човешката афлатоксикоза в развиващите се страни: преглед на токсикологията, експозицията, потенциалните последици за здравето и интервенциите. Am J Clin Nutr 80, 1106-1122. Уонг, З.А. и Hsieh, D.P.H., 1980. Сравнителният метаболизъм и токсикокинетика на афлатоксин В1 при маймуни, плъхове и мишки. Toxicol Appl Pharmacol 55, 115-125. Xiao, H., Madhyastha, S., Marquardt, R.R., Li, S., Vodela, J.K., Frohlich, A.A. и Kemppainen, B.W., 1996. Токсичност на охратоксин А, неговата отворена лактонна форма и няколко от неговите аналози: Взаимоотношения на структурна активност. Toxicol Appl Pharmacol 137, 182-192. Zahoor Ul Hassan, M.Z., Khan, A., Khan, I., Javed, Z. и Hussain, 2011. Ефекти от индивидуалното и комбинирано приложение на охратоксин А и афлатоксин В (1) в тъкани и яйца на кокошки разплодник от бял легорн. J Sci Food Agric doi: 10.1002/jsfa.4740. Железич, Д., Домиджан, А.М. и Peraica, М., 2006. ДНК увреждане от охратоксин А в бъбреците на плъхове, оценено чрез анализ на алкална комета. Braz J Med Biol Res 39, 1563 54

Цел, цели и очертания Глава 2

Цел, цели и очертания Глава 8: Най-важните констатации от предишните глави са разгледани в този раздел. Глава 9: Представени са основните изводи от изследователския проект. 59

Глава 3 Охратоксин А намалява причиненото от афлатоксин В1 увреждане на ДНК, открито от анализа на кометата в Hep G2 клетки Laura-Ana Corcuera., Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Amaia Azqueta, Adela López de Cerain Хранителна и химическа токсикология 49 (2011) 2883 2889

Глава 3 Резюме Микотоксини афлатоксин В1 (AFB1) и охратоксин А (ОТА) могат да присъстват заедно в хранителните стоки. Тези замърсители на храните се считат за генотоксини, действащи по различни механизми. Целта на тази работа е да се характеризират комбинираните генотоксични in vitro ефекти на двата микотоксина в Hep G2 клетки. За тази цел първо се определя цитотоксичността при изолирани и комбинирани лечения, за да се определи дозовия диапазон на проучванията за генотоксичност. Едновременното излагане на клетки на AFB1 + OTA в продължение на 24 часа води до адитивни ефекти. Генотоксичността се определя в Hep G2 клетки чрез модифициран анализ на комети с рестрикционни ензими (ендо III и FPG). Значително образуване на реактивни кислородни форми се открива както при единично, така и при комбинирано лечение. AFB1 е генотоксичен след 3 часа с външно метаболитно активиране (S9 микс) и след 24 часа без метаболитно активиране. Едновременното излагане на OTA значително намалява увреждането на ДНК, предизвикано от AFB1, не само при прекъсвания и апуринови места, но и в чувствителни към FPG места. Очевидното противоречие между адитивните цитотоксични ефекти и антагоничните генотоксични ефекти може да бъде обяснено, ако AFB1 и OTA се конкурират за едни и същи CYP, което води до повече ROS, но по-малко адукти на AFB1. 64

OTA намалява генотоксичността на AFB1 in vitro Таблица 1: Стойности на IC50 в клетъчна линия Hep G2 след 24 часа еднократно или комбинирано лечение. IC50 µm HepG-2 AFB1 100 OTA 360 OTA + 100 µm AFB1 100 OTA + 150 µm AFB1 200 Фигура 1: Криви на жизнеспособност на Hep G2 след 24 часа инкубация с OTA и AFB1 самостоятелно и в комбинация, получени с MTT анализа. За да се наблюдава значителния ефект на микотоксините заедно, всяка комбинация се сравнява с единичното третиране на OTA (р 0,05) или 100 и 150 µm AFB1 (без значение). Показани са средните стойности и SD от три експеримента. Генотоксичност На 3 часа без смес от плъхове S9, AFB1 не предизвиква разкъсвания на вериги на ДНК или места на AP (фигура 2А) и не са открити значителни увреждания след ензимната обработка (фигура 2В). За разлика от това, когато се използва метаболитно активиране, значителна връзка доза-отговор е очевидна при директни разкъсвания на ДНК вериги, започващи от 30 µm (фигура 2С). Нещо повече, значително увеличение на увреждането на ДНК е установено от FPG при същата концентрация (фигура 2D). След 24 часа лечение с AFB1 се наблюдава ефект на реагиране на дозата при значителни разкъсвания на вериги, предизвикани от ДНК (фигура 2Е). В допълнение, при 6 µm беше показана ясна значителна индукция на FPG места, която не се появи на 3 h (фигура 2F). № 71

OTA намалява генотоксичността на AFB1 in vitro Фигура 2: Генотоксични ефекти на AFB1 след 3 часа (A и B), 3 часа с 2,5% смес от плъхове S9 (C и D) и 24 часа лечение (E и F), измерено с анализа на кометата . Увреждането на ДНК е измерено в произволни единици (0-400). ДНК веригите се разкъсват и местата на AP се нанасят в A, C и E. Оксидативното увреждане, открито чрез след усвояване с ензимите, е представено като net endo III (оранжево) и нетно FPG-чувствителни места (жълто) в B, D и F. За да се наблюдават значимите ефекти от обработките, всяка концентрация се сравнява с нетретирани клетки (C-) (* p 0,05). Показани са средните стойности и SD от три експеримента. 73

Глава 3 Фигура 3: Сравнителни парцели на увреждане на ДНК след излагане на Hep G2 клетки на AFB1 и AFB1 + 50 µm OTA в продължение на 24 часа, измерено с анализа на кометата. Увреждането на ДНК е измерено в произволни единици (0-400). Увреждането на ДНК се измерва като разкъсвания на веригите на ДНК и места на АР (А) или окислително увреждане, изразени като чувствителни места на нетна ендо III (В) или FPG (С). За да се наблюдават значителни разлики между леченията, комбинациите AFB1 + OTA бяха сравнени с единични експозиции на AFB1 (* p 0,05). Показани са средните стойности и SD от три експеримента. Фигура 4: Вътреклетъчни ROS на Hep G2 клетки, третирани с AFB1 (A в синьо), OTA (B) и смеси от AFB1 + 50 µm OTA (A в светло синьо) за 24 часа. Нивата на ROS са изразени като флуоресценция на процент оцеляване. Резултатите бяха сравнени с техния отрицателен контрол (* р 0,05). Показани са средните стойности и SD на четири експеримента. 74

OTA намалява генотоксичността на AFB1 in vitro 1082-1090. Turesky, R.J., 2005. Перспектива: охратоксин А не е генотоксичен канцероген. Chem Res Toxicol 18, Uhl, М., Helma, С. и Knasmuller, S., 1999. Едноклетъчни анализи за гел електрофореза с клетки, получени от човешки хепатом (Hep G2). Mutat Res 441, 215-224. Urrego Novoa, J.R. и Diaz, G.J., 2006. Афлатоксини и неговите механизми на токсичност при рак на черния дроб. Rev Fac Med Una 54, 108-116. Wang, H. и Joseph, J.A., 1999. Количествено определяне на клетъчния оксидативен стрес чрез анализ на дихлорофлуоресцеин с помощта на четец на микроплаки. Безплатен Radic Biol Med 27, 612-616. 83

Глава 4 Какаовият екстракт, обогатен с полифенол, намалява свободните радикали, произвеждани от микотоксини Laura-Ana Corcuera, Susana Amézqueta, Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Sonia Touriño, Jusep Lluis Torres, Adela López de Cerain Food and Chemical Toxicology 50 (2012) 989-99599 (1995) 989-995

PECE намалява свободните радикали in vitro, поддържани при -20 ° C до употреба. Разтворите PECE и AFB1 се държат на тъмно, за да се избегне влошаване на светлината. Експериментите са проведени без фетален телешки серум (FCS), за да се избегнат серумни взаимодействия с PECE или микотоксини, свързващи се с протеини. Статистически анализ Бяха проведени три независими експеримента за проверка на цитотоксичността и индукцията на ROS. Данните са представени чрез описателен анализ [средно ± стандартно отклонение (SD) на повторените експерименти]. Сравненията бяха извършени чрез непараметричен H-тест на Kruskal-Wallis и U-тест на Mann-Whitney. P 0,05 се приема като ниво на значимост. Резултати Приготвяне на PECE и среден състав на полифенол. Какаовият екстракт вода: ацетон 3: 7, съдържащ C и EC мономери и олигомери, се получава, както е описано по-горе. Бяха изготвени калибрационни криви на C, EC, Cya-Cat и Cya-EC, обхващащи работния диапазон. Шест стандарта на всяко съединение бяха анализирани и беше получен линеен отговор спрямо концентрация. Анализите на пробите се извършват в три екземпляра с RSD