• Е тук:
  • Започнете
  • Обучение без модул
  • Напредък в редактирането на генома с CRISPR Cas 9

Напредък в редактирането на генома с CRISPR Cas 9

CRISPR: Клъстерирани редовно разпръснати къси палиндромни повторения, групирани и редовно разположени къси палиндромни повторения

напредък

Приложенията на системите CRISPR-Cas се развиват през последните години, откакто е открито присъствието му в бактериите. Оттогава неговото използване се предлага в различни области като земеделие, изследване на генетично базирани заболявания в клетъчни и животински модели, при производството на ферментирали храни, в устойчивостта на антибиотици в бактериите и като възможна генна терапия.

1987 г.: Йошизуми Ишино открива съществуването на палиндромни повторни последователности в ДНК на ешерихия коли.

1993 г.: Francisco J. M. Mojica, чрез секвениране на частта от генома на халофилни археи бактерии, обитаващи солените площи Санта Пола, идентифицира палиндромни последователности от 30 двойки основи, разделени една от друга с фрагменти от 36 базови двойки, така наречените дистанционни елементи.

2000 г.: Групата, ръководена от Франсиско J. M. Mojica, намери, търсейки в бази данни, голям брой от тези повтарящи се последователности в бактерии, археи и митохондрии и предложи името CRISPR, което означава "Групирани и редовно разпръснати кратки палиндромични повторения".

2002 г.: Група холандски микробиолози описват набор от гени, които кодират нуклеази, свързани с CRISPR последователности (cas или CRISPR-свързани гени)

2005 г.: Установено е, че някои от дистанционните елементи в системите CRISPR са получени от ДНК източници на вируси и плазмиди. Изследователската група на Франсиско J. Mojica предполага, че свързаните дистанционни елементи могат да бъдат част от имунната система на бактериите.

2008 г.: Джон ван дер Оост показва, че в бактерията E-Scherichia coli, спейсерите, които са получени от фаг, се транскрибират в РНК, наречена CRISPR РНК (crRNAs), която се свързва с ДНК на вируса и насочва Cas протеините към целевата ДНК за извършване на двунишково рязане.

2009 г.: CRISPR-Cas9 е показан да създава целенасочени ДНК двуверижни прекъсвания в точни позиции и също така е потвърдено, че Cas9 е единственият протеин, необходим за разцепване в системата CRISPR-Cas9.

2011 г.: Emmanuelle Charpentier от университета Umee извършва малка последователност на РНК в Streptococcus pyogenes, която съдържа система CRISPR-Cas9 и открива, че в допълнение към crRNA, има и втора РНК, наречена CRISPR РНК транзактивация (tracrRNA). Това също така показва, че tracrRNA работи заедно с crRNA, за да насочи Cas9 към своите цели.

2012 г.: Учените Емануел Шарпентие и Дженифър Дудна от Калифорнийския университет в Бъркли демонстрират как да се използва CRISPR като програмируем инструмент за редактиране, който може да изреже всяка верига на ДНК in vitro.

2013: Изследователят Фън Джанг успешно адаптира системата CRISPR-Cas9 за редактиране на генома в еукариотни клетки чрез проектиране на два различни ортологични гена Cas9 и демонстриране на специфично разцепване на генома в човешки и миши клетки.

Геномът на бактериите се състои от две вериги кръгова ДНК, като тези вериги са взаимно допълващи се. Когато четем генома, който е приблизително 4 или 5 милиона букви, виждаме поредица от повторения, които се повтарят няколко пъти в целия геном и които са раздалечени. Всяка от тези повтарящи се единици се нарича CRISPR, които са „Клъстерирани и с редовни интервали с къси палиндромни повторения“. След всяко повторение са къси сегменти на спейсър ДНК от ДНК на вируса на бактериофаги. Много близо до тези повторения можете да намерите cas гените, които кодират тип нуклеазни протеини, които са изпълнителите на CRISPR активността.

Бактериите, точно както хората, ще бъдат заразени от вируси, които ще разпознаят бактериите по специфични рецептори на мембраната им. Вирусът ще въведе своя генетичен материал вътре в бактериите и ще използва собствената машина на бактериите, за да произведе хиляди вирусни частици, които ще счупят обвивката на бактериите и ще бъдат пуснати в околната среда, за да заразят другите. Бактериите, оцелели при атаката на вируса, ще запазят фрагмент от ДНК от вируса и ще го включат като дистанционер в своята система CRISPR-Cas и ще го запазят поколение след поколение. Тези дистанционни елементи ще бъдат транскрибирани в РНК, наречена "CRIPR RNA" (crRNAs), която ще действа като ръководство за Cas протеина и която ще се свърже с ДНК на нахлуващия вирус в случай на втора инфекция от същия вирус.

Когато същият вирус отново зарази бактерията, crRNA, съответстваща на спейсъра на този вирус, ще се присъедини към двойната верига на ДНК на вируса чрез комплементарност. След като се присъедини към двойната верига на ДНК с помощта на трансактивационната РНК (tracrRNA), те ще направляват протеина Cas 9, който е ендонуклеаза, която ще доведе до разрязване на двойната верига на ДНК на вируса, като по този начин предотвратява инфекцията. Следователно системата CRISPR-Cas се счита за придобита имунна система при различни организми.

През 2012 г. учените Емануел Шарпентие и Дженифър Дудна демонстрираха как да използват CRISPR като програмируем инструмент за редактиране, който може да се използва за изрязване на всяка двойна верига на ДНК in vitro. По този начин е възможно да програмирате системата да отиде в определена позиция на която и да е ДНК и да я изреже, за това те използват най-простата система CRISPR, която се основава на протеин, наречен Cas 9. Те демонстрираха, че си струва с информацията на Cas9 и направляваща РНК, която има комплементарната последователност на фрагмента, който искате да изрежете, смесвате това с фрагмента, в който искате да произведете разрез, и Cas 9 протеинът ще отиде там, където тази РНК-насока го насочва и ще отрязва в позицията, която посочвате.

Протеинът Cas 9 прави двуверижен разрез, действа като молекулярни ножици върху ДНК. Системата CRISPR има способността да насочва към определена последователност. РНК молекула от 20 рибонуклеотиди (crRNA) се сдвоява с 20 нуклеотида от ДНК веригата и Cas9 протеинът е рестрикционен ензим с висока специфичност, който ще доведе до разрязване на определено място.

Когато има разрез в двойната верига на ДНК, физическата приемственост ще бъде нарушена и информацията може да бъде загубена в следващия кръг на разделяне в следващите клетъчни цикли, следователно клетката има два механизма за възстановяване на ДНК.

Има два механизма за ремонт:

Съюз на нехомологични цели:

Този разрез се открива и започва да се разгражда и добавя нуклеотиди на случаен принцип с ефект на цип. Вероятно оригиналната структура е променена и нуклеотидите ще бъдат вмъкнати или изтрити, така че ще имаме така наречените "Indels" и ще настъпи нарушение на гена. Този ген ще спре да работи. Достатъчно е да генерираме мутант, който да се отреже в определена област от ДНК. Това ни интересува в случай, че искаме да загубим функционалността на даден ген.

Хомоложен директен ремонт:

Ако дадем на системата последователност, която е хомоложна на областите, съседни на разреза и които съдържат нови последователности, тези последователности ще бъдат интегрирани, тъй като клетката ще я използва като шаблон. Когато трябва да поправи, той ще се опита да следва този шаблон и да въведе последователности, които не са били там преди, или може да се включи мутация, или мутацията да се премахне и да се възстанови правилната последователност. CRIPSR само реже ДНК, но задейства процеса на поправка.

Тези две форми на възстановяване ни позволяват да изследваме функционалността на ген, да изследваме генетично базирана болест, която има мутация, вмъкване или заместване.

Редактиране на генома

Необходими елементи

Първо имаме целевата последователност на двуверижната ДНК, която искаме да изрежем. Ще имаме направляваща РНК, която се образува от РНК, която се свързва с целевата последователност, и трансактивационна РНК, която показва на протеина Cas 9 къде трябва да бъде разположена за извършване на разреза. И накрая протеинът Cas 9, който е ендонуклеазата, която извършва разрязването-

За да се улесни редактирането на генома, е проектирана направляваща РНК (gRNA), която представлява химерна РНК, съдържаща всички основни компоненти на crRNA и tracrRNA. Разработени са множество варианти на CRISPR/Cas9, разпознаващи 20 или 24 nt последователности, които съответстват на конструирани gRNA последователности и 2-4 nt PAM последователности в целевите места. Следователно, CRISPR/Cas9 теоретично може да се насочи към специфична ДНК последователност с 22–29 nt, която е уникална за повечето геноми. Неотдавнашни проучвания обаче установиха, че CRISPR/Cas9 има висок толеранс към несъответствия на базови двойки между gRNA и нейната комплементарна прицелна последователност.

Различни функции на системата CRISPR

Приложения на CRISPR-Cas9

Производство на ферментирали продукти за предотвратяване на замърсяване на бактериални култури с вируси.

Типизирането на бактерии може да се извърши според дистанционерите, които те съдържат.

Резистентност към антибиотици

Селективен антимикробен дизайн.

Създайте клетъчни или животински модели на генетично базирани заболявания

Извършвайте епигенетични модификации

Култури, устойчиви на екстремни условия

Бавно узряване на плодовете

Говеда с по-голяма мускулна маса

Безопасни животински органи за трансплантация на хора

Излекувайте/предотвратете заболявания. Вируси: ХИВ, херпес, хепатит В, мононуклеоза. инфекциозен.

Устойчиви на малария комари

Соматична генна терапия

CAR-T лечения.

Ограничения на CRISPR:

Извън целта: Разрязванията могат да възникнат в последователности, различни от целевата цел.

Имуногенност: Системите CRISPR-Cas идват от бактерии и могат да предизвикат имунен отговор, ако сме били изложени на предишна инфекция от този микроорганизъм. Пример: Streptococcus Pyogenes.

Оцеляване на генетично променени клетки.

Не можем да контролираме ефикасност в хомоложен ремонт (HDR).

Ефективност, тъканна специфичност и ефективност на трансфера.

Мозайки: Промените може да не настъпят във всички клетки.