Обобщение

Този протокол предоставя надежден метод за установяване на хуманизирани мишки с човешката имунна система и чернодробни клетки. Възстановените двойни имунодефицитни мишки, постигнати чрез интраслезивна инжекция на човешки хепатоцити и CD34 + хематопоетични стволови клетки, са податливи на инфекция с човешки имунодефицитен вирус-1 и рекапитулирани чернодробни увреждания, наблюдавани при пациенти, заразени с ХИВ.

Резюме

Въведение

От появата на антиретровирусната терапия се наблюдава значително намаляване на смъртните случаи, свързани с ХИВ-1 моноинфекция. Въпреки това, чернодробното заболяване се очертава като честа причина за заболеваемост при ХИВ-инфектирани пациенти 1, 2. Ко-инфекциите с вируса на хепатит с HIV-1 инфекция са по-чести, като представляват между 10% и 30% от заразените с ХИВ хора в САЩ 3, 4, 5 .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Този протокол е одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните (IACUC) към Медицинския център на Университета в Небраска.

ЗАБЕЛЕЖКА: Получете одобрение от местната IACUC, преди да провеждате опити с животни.

1. Обработка на кръв от пъпна връв и изолиране на шумано HSpC

2. Подготовка на човешки хепатоцити за трансплантация

  1. Отстранете криоконсервираните хепатоцити от течен азот, бързо потопете флакона във водната баня и размразете за около 90 - 120 s.
  2. Отстранете капачката от флакона и изсипете размразените хепатоцити в 50 ml конична тръба с нагрята размразяваща среда.
  3. Суспендирайте клетките, като разклатите тръбата от 50 ml на ръка за няколко секунди.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Не завихряйте тръбата.
  4. Отблъсквайте клетките при 100 х g за 8 минути при стайна температура. Измийте гранулираните клетки в PBS с 0,1% BSA и разклатете с пресен или размразен HSCC (съотношение 10: 1) в PBS в краен обем от 80 μl/мишка.

3. Управление на животни, скрининг, генотипизиране и лечение на човешки hSPC и трансплантация на хепатоцити

4. Валидиране на човешкия чернодробен трансплантат чрез ELISA и човешката имунна система чрез поточна цитометрия

ЗАБЕЛЕЖКА: Оценявайте възстановяването на човешкия черен дроб и имунната система ежемесечно, започвайки 1 месец след трансплантация чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и съответно поточна цитометрия.

5. ХИВ инфекция на мишки TK-NOG и нейният ефект върху черния дроб и имунната система на човека

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

двойния

Фигура 1 : Схема на обогатяване на CD34 + клетки от кръв от пъпна връв. (ДА СЕ) Кръвната връв се наслоява в среда за отделяне на лимфоцити (LSM) и се центрофугира, за да се изолира буфистният слой. (Б.) LS колоните се поставят върху магнитна стойка и се изплакват с BSA буфер, последвано от добавяне на слой buffy. Клетките, положителни за CD34, се улавят в колоните и CD34 клетките се елуират в отделни епруветки. CD34 + клетките, уловени в колонови смоли, се потапят и клетките се събират в нова епруветка. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 4 : Концентрацията на албумин се измерва чрез ELISA в серума на двойни човешки мишки. Мишките се трансплантират с човешки хепатоцити (HEP) и CD34 + стволови/прогениторни хематопоетични клетки (HSPC) (# 11). Серумът се събира по различно време на 1, 4 и 6 месеца след трансплантацията и се правят разреждания, за да се коригират неизвестни концентрации на пробата в диапазона от стандарти. Всеки символ представлява индивидуална стойност на мишката. Резултатите представят медианата, както и индивидуалните стойности. * Р 8. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 5: Влияе на HIV-1 в серумни нива на албумин и изчерпване на човешки CK18 + хепатоцити в черния дроб на двойни човешки мишки. (ДА СЕ) Концентрациите на албумин се наблюдават при незаразени мишки (# 9), трансплантирани с човешки HEP и HSpCs на 1 и 4 месеца. Мишките се заразяват (n x 10) с HIV на 4-5 месеца след трансплантацията и се жертват 5 седмици след инфекцията. Всеки символ представлява индивидуална стойност на мишката. Резултатите представят медианата, както и индивидуалните стойности. * Р 8. (Б.) Петмикронни чернодробни секции от незаразени TK-NOG мишки (HEPs + HSP, ляв панел) и заразени с HIV TK-NOG мишки (HEPs + HSCCP + HIV, десен панел) са фиксирани, вградени в парафин и оцветени за анти-човешки антитела към цитокератин-18 (CK18). HIV-1, причиняващ изчерпване на CK18 + хепатоцити, се доказва от площ, по-малко заета от човешки CK18 + клетки. Представените тук резултати са от незаразена мишка и заразена с HIV мишка, трансплантирана с два човешки хепатоцита и HSPC.


Фигура 6 : Съотношение на CD4 + клетки към CD8 + T в периферната кръв и черния дроб на възстановени двойни мишки, които не са заразени и заразени с HIV-1. За двойно възстановени неинфектирани мишки: затворен кръг; HEP + HSPC; кръв # 7; черен дроб # 6. За мишки, заразени с HIV-1: отворени кръгове; HEP + HSPC + HIV; кръв n до 10; черен дроб # 11. Резултатите представляват медиана, както и индивидуални стойности. * Р 8. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

В момента двойната хуманизация се показва чрез трансплантация на човешки CD34 + HSCCP и фетални чернодробни клетки; Работата с новородени животни обаче създава технически проблеми 13, 14. HSCCPs могат да бъдат получени или изолирани от множество източници, като фетални чернодробни клетки (FLC), ембрионални стволови клетки (ESC) и CB. Етичните въпроси обаче ограничават използването на ESC и FLC. CB няма такова ограничение и е по-полезна алтернатива за получаване на HSCCP, както и че е ценен източник на примитивни хемопоетични стволови и прогениторни клетки, които могат да възстановят функционалната имунна система. Кръвната пъпна връв не трябва да е по-стара от един ден, когато се използва за изолиране на HSCCPs, тъй като ефективността на HSCCPs се влияе значително от възрастта. Чистотата на изолираните HSCCPs трябва да се провери преди криоконсервиращите клетки. Избягва се кръстосано замърсяване на CD3 + Т лимфоцитите, тъй като може да доведе до системно заболяване на присадката на мишка-гостоприемник и остра алорежекция на HPH при трансплантация с несъответстващи клетки.

Наличните в търговската мрежа хепатоцити са използвани като източник за възстановяване на черния дроб 8, 13. Възрастните хепатоцити са предпочитани за установяване на възстановяването на черния дроб поради тяхната по-голяма ефективност при присаждане и устойчивост за дълъг период от време 29.

Наличието на човешка имунна система в модел на мишка повишава нивата на ALB, както беше показано по-рано 30, 31. Ефективността на хепатоцитите и възстановяването на имунната система обаче може да варира в зависимост от различните източници на донорни клетки и зависи от мишката реципиент. Следователно, всяка мишка трябва да бъде оценена за присаждане и най-критичната част е да се използват антитела или реагенти, които са специфични за човека и не реагират кръстосано с миши клетки. Специфичните за човека реагенти и антитела, използвани в изследването, представени тук, са подробно описани в Таблица на материалите. Ако антитела, различни от посочените в Таблица с материали за изследването не забравяйте да проверите за човешка специфичност.

Оптималното условие би било трансплантацията на сингенни клетки; това обаче е технически трудно постижимо. Винаги, когато е възможно, HSCCPs и хепатоцитите трябва да бъдат обединени от донори с частично сдвоени човешки левкоцитни антигени от клас 1 (като HLA-A2).

За изследване на мишки за изследвания на ХИВ се взема кръв в множество моменти от време, за да се определи оптималното възстановяване на черния дроб и имунната система; Предпочитат се проточна цитометрия и ELISA, тъй като те могат да се извършват само с малко количество кръв. Кръвни клетки и серум от една и съща проба могат да се използват съответно за поточна цитометрия и ELISA. Важно е да се извършват адекватни серумни разреждания във всяка точка от време (диапазон 1000 - 40 000), за да се оценят нивата на ALB, така че неизвестните концентрации да могат да бъдат поставени в рамките на стандартния диапазон на концентрация (обхват на комплекта: 6,25 - 400 ng/ml).

Провъзпалителните цитокини в отговор на HIV-1 инфекция в присъствието на човешката имунна система също могат да бъдат полезни при справяне с взаимодействието на хепатоцитите и имунните клетки. Моделът е полезен за показване на имунопатогенезата на индуцирано от ХИВ-1 чернодробно заболяване, тъй като рекапитулира увреждането на черния дроб по същия начин, както при хората, доказано от ниско съотношение CD4: CD8, намаляване на нивата на ALB, смърт от човешки хепатоцити и имунно активиране на черния дроб. Моделът има и някои ограничения, като ниско ниво на цитотоксична активност на Т-клетките и нарушено превключване на клас имуноглобулин. Поради наличието както на човешката имунна система, така и на черния дроб, представеният тук модел е обещаващ за HIV-1 вирус и коинфекции на хепатит, хронична хепатитна инфекция (за изясняване на механизмите на имунния отговор срещу хепатит) и като модел на цироза.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.