Обобщение

Достъпът е предоставен от

Главен

В сравнение с генотипно HLA-идентична трансплантация на костен мозък (BMT), несвързаният донорен трансплантат (URD) ​​е свързан с по-висока смъртност. Тежката остра болест присадка срещу гостоприемник (aGVHD) и неуспехът на присадката са водещите причини за свързаната с трансплантацията смъртност (SMI) в тази обстановка и могат да бъдат свързани със степента на HLA несъвместимост.

В допълнение към молекулярното типизиране са разработени клетъчни тестове, за да се предскаже въздействието на несъответствията от HLA клас I върху вероятността за aGVHD. Те се състоят от определяне на честотата на донорните Т-клетъчни цитотоксични предшественици (CTLp) с антирецепторна специфичност (посока GVHD) .17 Ниските честоти на CTLp силно корелират с HLA-A и -B съвместимостта.

Тъй като употребата на URD-BMT се е увеличила с увеличаването на размера на донорските регистри, спешно са необходими повече данни по тази тема, за да се подобри клиничната практика, а ретроспективната оценка на предишния опит остава необходима за всеки клиничен екип от BMT. Целта на това проучване е да се определи въздействието на несъответствията от HLA клас I и II върху изхода на пациента след URD-BMT. Пренаписахме HLA клас I и II, използвайки ДНК техники с висока резолюция, в 69 двойки донори и реципиенти, трансплантирани между септември 1988 г. и юни 1998 г. в нашата институция. Честотите на CTLp също бяха определени в 33 от тези двойки.

материали и методи

BMT процедура

69-те последователни процедури за URD-BMT, извършени между септември 1988 г. и юни 1998 г. в университетската болница „Анри-Мондор“, са включени в изследването (Таблица 1). Три пациенти са присадени два пъти. Донорите бяха идентифицирани чрез европейските регистри и NMDP. Основните характеристики на пациентите преди BMT са обобщени в таблица 1. Пациентите са разделени на две групи според състоянието на заболяването в BMT: 32-те реципиенти с ХМЛ в първата хронична фаза или острата левкемия в първата. стандартната рискова група, а 37-те пациенти с по-напреднало заболяване при BMT формират високорисковата група.

Таблица в пълен размер

Първите 66 процедури за BMT са извършени след миелоаблативно кондициониране, включително общо облъчване на тялото (n = 59) или режим на базата на бусулфан (n = 7). Трите втори присадки с различен донор са извършени след прокарбазин: циклофосфамид и антитимоцитен глобулин. Профилактиката на GVHD комбинира циклоспорин и метотрексат съгласно протокола от Сиатъл.18 Всички пациенти са получили немодифициран костен мозък. Острият GVHD е класифициран, както е дефинирано от Glucksberg et al. 19 и се лекува със стандартни дози стероиди, последвани, в случай на неуспех, от високи дози стероиди или ATG.

HLA типизиране и сравнение между пациент и донор

HLA Pre-BMT типизиране:

Донорите бяха избрани въз основа на HLA-A и -B типизиране, използвайки техниката на микролинфитотоксичност20, идентифицирайки съответните специфики, признати от Световната здравна организация (СЗО) по време на трансплантацията. Типирането на HLA клас II се извършва с техниките, налични по време на трансплантацията. Следователно, HLA-DR и -DQ фенотипите са изследвани при ниска разделителна способност в 14 двойки чрез серология (n = 3) или RFLP (полиморфизъм на дължината на рестрикционен фрагмент) (n = 11), докато в останалите 55 двойки, HLA-DRB1 - Типизирането на DQB1 и -DPB1 се извършва при висока разделителна способност, използвайки PCR-dot dot blot (Innogenetics, Брюксел, Белгия) плюс PCR-RFLP2122 за HLA-DRB1 и -DQB1.

HLA ретроспективно писане:

Типирането на HLA клас I се извършва ретроспективно от PCR-SSP (грунд, специфичен за последователността) (Dynal, Осло, Норвегия).

Серологичните "заготовки" на HLA-A и HLA-B бяха пренаписани с ДНК типиране с ниска разделителна способност. Всички серологично експресирани HLA-A антигени са определени на алелно ниво. Серологично експресираните HLA-B антигени бяха дефинирани с висока разделителна способност в зависимост от наличността на търговски комплекти (HLA-B фенотипът беше напълно дефиниран при висока разделителна способност при 39 от 69 двойки донори-реципиенти). Локусът на HLA-C е изследван с помощта на техника, която определя алелите Cw1-18.

HLA-DRB1, -DQB1 и -DPB1 бяха пренаписани в 14 двойки донор-реципиент, които преди това бяха записани с ниска резолюция.

Изчисляване на честотите на CTL-p

CTLp анализите се провеждат, както е описано от Kaminski et al. Накратко, анализите се провеждат в "посока на GVHD", като донорните клетки се използват като клетки-респонденти, а клетките реципиенти като стимулиращи клетки. Ямките бяха оценени положително, ако тяхното освобождаване от 51 Cr е по-голямо от средното плюс 3 стандартни отклонения (SD) от отрицателния контрол (стимулиращи клетки без отговарящи клетки). Честотите на CTLp под 1/300000 се считат за отрицателни

статистически методи

Данните бяха събрани и актуализирани към 15 ноември 1998 г., осигурявайки минимално проследяване на пациент от 7 месеца, максимум 122 месеца и средно проследяване на оцелелите от 29 месеца (диапазон 7-122 месеца). Очакваните вероятности за aGVHD, MRT и оцеляването бяха изчислени и начертани с помощта на метода на Kaplan-Meier и сравнени с помощта на log-rank тест. Пациентите, подложени на втора трансплантация, бяха цензурирани за първата трансплантация на датата на втората BMT.

Резултати

HLA типизиране и pCTL честоти

По време на трансплантацията беше известно, че шест двойки донори и реципиенти не са аналогични за HLA-A или -B антиген (UPN 671, 588, 536, 620, 629, 643); две двойки са несъответствия HLA-DQB1 (UPN 495, 547) и една двойка са несъответствия HLA-A и -DQB (UPN 502) (Таблица 2).

Таблица в пълен размер

Ретроспективно типизиране на ДНК потвърди всички серологично идентифицирани несъответствия. Допълнителни несъответствия бяха открити в седем от деветте известни несъответстващи двойки донор-реципиент (Таблица 2). Сред останалите 60 двойки донори и реципиенти, неидентифицирани HLA несъвместимости по време на трансплантацията са открити при 27/60 (45%), докато 33/60 (55%) двойки са потвърдени за HLA съвпадение. A, -B, -C, -DRB1 и -DQB1 алели. Следователно, след ретроспективно типизиране, общо 36/69 (52%) двойки дарители и получатели не съвпадат. Сред тези двойки само 27 не съответстват на антигени от HLA клас I, пет единични двойки не съответстват на антигени HLA клас II и четири не съответстват на антигени HLA клас I и клас II.

HLA клас I

Серологично празните фенотипове винаги се потвърждават чрез типизиране на ДНК с ниска разделителна способност, което също показва, че човек е бил погрешно идентифициран чрез серологично типизиране (HLA-B57 (17) вместо HLA-B58 (17) (UPN 502)). Сред 62 двойки, които по време на трансплантация са били серологично съвпадащи с HLA-A и -B, при 13 след ретроспективно типизиране са открити несъответствия на HLA-A и/или -B (Таблици 2 и 3). HLA-B антигените бяха определени чрез типизиране с висока разделителна способност в 17/33 съвпадащи двойки донор-реципиент и 22/36 несъответстващи двойки.

Таблица в пълен размер

Сред 69 двойки 23 не отговарят на HLA-C (Таблица 3). Десет са имали само несъответствие на HLA-C антиген, докато 12 също са имали несъответствия HLA-A и/или -B и един също е имал несъответствие HLA клас II (Таблици 2 и 4). Всички HLA-B молекули бяха набрани с висока разделителна способност във всичките 10 двойки само с несъответствия HLA-C. Следователно, след ретроспективно типизиране на ДНК, 31/69 (45%) двойки имат поне едно несъответствие на HLA клас I.

Таблица в пълен размер

HLA клас II

Сред 14 двойки донори и реципиенти, които бяха фенотипизирани с ниска резолюция по време на трансплантацията, бяха открити несъответствия чрез ретроспективно типизиране в шест предполагаеми HLA двойки донори и реципиенти клас II; от тях три бяха несъответствия HLA-DQB1 (UPN 392, 441, 380), едно беше несъответствие HLA-DRB1 и -DQB1 (UPN 373) и две бяха несъответствия HLA клас I и клас II (UPN 426, 306) (Таблица 2). По този начин, 9/69 двойки донори-реципиенти са несъответстващи на HLA клас II.

Типирането на HLA-DPB1 показва, че само девет двойки пациенти и донори са били съчетани в това отношение. Общо само пет двойки са идентични HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 и -DPB1.

Хаплотипове на предците

За да определим дали честотата на несъответствие, открито чрез типизиране на ДНК с висока разделителна способност, може да бъде предсказана въз основа на запазени хаплотипове, класифицирахме HLA фенотипите на двойките донори-реципиенти, идентифицирани по време на трансплантацията, въз основа на вероятното присъствие на един или два от 25-те родови HLA-ABDR (AH) хаплотипове, определени от Christiansen et al23. Наличието на HA не може да бъде анализирано при осем двойки донор-реципиент (седем с известни несъответствия на HLA по време на трансплантацията и един с множество несъответствия, предотвратяващи възстановяването на хаплотипа). Две двойки могат да имат две AH, 29 една AH и 30 не AH. Сред анализираните 122 хаплотипа, несъответствията от HLA клас I са по-чести след типизиране на ДНК с висока разделителна способност в хаплотипите, считани за не-родови, отколкото в HA (21/89 срещу 2/33) (P = 0,017 тест на Фишер точно).

Честотите на CTLp бяха определени за 33 двойки. След типизиране на ДНК, 14 двойки са несъответствия на HLA клас I в посока GVHD и 19 двойки са съчетани (Таблица 5). Сред 14-те несъответстващи двойки е установена висока честота на CTLp при девет двойки и ниска честота при пет двойки. От тези пет последни двойки две бяха несъответствия на HLA-A (UPN 671, 547), една беше несъответствие на HLA-B (UPN 642) и две бяха несъответствия на HLA-C (UPN 680, 668). Ниски CTLp честоти бяха открити в 19 двойки, съвпадащи в посока GVHD.

Таблица в пълен размер

Присаждане

Шест пациенти са починали преди 30 ден след трансплантацията, което означава, че 63 присадки могат да бъдат оценени. Неуспех на присадката се случи в пет случая. Четири от петте двойки са HLA клас I, несъответстващи в посоката на HVG (хост срещу присадка) (UPN 526, 436, 617, 536) и една е сравнена. Двама пациенти са имали несъответствие на HLA-C антиген (UPN 617, 436), един е имал несъответствие на HLA-B антиген (UPN 526), ​​а един е имал несъответствие HLA-B и -C (UPN 536).

AGVHD, TRM и оцеляване

Деветнадесет от 66 пациенти са живи (медиана 28 месеца, диапазон 7-122 месеца след BMT), включително един пациент с автологично възстановяване (UPN 617) и един пациент с рецидивирал лимфом (UPN 600). Общата степен на преживяемост за цялата кохорта е 28 ± 6%, а стойностите корелират с хематологичния статус (55% срещу 9%) (Р

разделителна

Каплан-Майер изчислява преживяемостта при пациенти със „стандартен рисков статус“ (плътна линия) в сравнение с пациенти с „високорисков статус“ (пунктирана линия). Вероятността за оцеляване е 55% за пациенти със "стандартен рисков статус" и 9% за пациенти с "високорисков статус" (P

Оценките на преживяемостта на Kaplan-Meier при пациенти, които са претърпели HLA клас I и II съвпадащи трансплантации (плътна линия) в сравнение с тези, които са получили HLA клас I и II несъответстващи трансплантации (пунктирана линия). Вероятността за оцеляване е 40% за съвпадащи пациенти и 20% за несъответстващи пациенти (P

Вероятност за aGVHD степен III-IV в HLA съвпадащи (плътна линия) и HLA несъответстващи трансплантации (пунктирана линия). Сред пациентите, които могат да бъдат оценени за GVHD, 2/30 съвпадащи пациенти и 16/33 несъответстващи пациенти са имали тежък aGVHD (P

Оценките за преживяемост на Kaplan-Meier при пациенти, които са получили съответстващи трансплантации на HLA клас I и II (плътна линия) в сравнение с тези, които са получили съвпадащи трансплантации на клас HLA от несдвоени клас II (пунктирана линия). Вероятността за оцеляване е 42% за HLA клас I и II съвпадащи трансплантации и 18% за HLA клас I несдвоени клас II (P

Сравнение на оценките за преживяемост на Каплан-Майер в четири подгрупи: "статут на стандартен риск" и съответстващи трансплантации; „стандартен рисков статус“ и несъответстващи трансплантации; „високорисков статус“ и съответстващи трансплантации; „Високорисков статус“ и несъответстващи трансплантации. Вероятността за оцеляване е била съответно 66%, 31%, 9% и 8%.

Изображение в пълен размер

Дискусия

Нашето проучване ясно потвърждава, че оцеляването след URD-BMT може да се подобри чрез комбиниране на донор и реципиент за HLA-A, -B, -C на високо ниво на разделителна способност, което показва, че несъвместимостите на HLA се откриват само чрез въвеждане. Висока резолюция (т.е. пропусната по конвенционални техники) са клинично значими. Въпреки че това е известно от няколко години за съвместимост с HLA клас II, то е установено само за HLA клас I в две неотдавнашни проучвания.910 Нашето проучване показва високата честота на несъответствия на HLA клас I между HLA-A и -B серологично идентичен донор -получатели двойки. В действителност, HLA-A и/или -B алелни несъответствия са открити в 13/62 (21%) серологично съвпадащи двойки и в 6/7 (86%) двойки, за които е известно, че не са съвпаднали по време на трансплантацията. Освен това, това проучване подчертава високата честота на несъответствие на HLA-C (23/69, 33%), което се е случило в 11/23 от случаите без HLA-A и/или -B съвпадение.

Интересното е, че нашият анализ предполага, че HA са по-рядко свързани с HLA алелни различия от клас I, според проучването на Prasad et al.12. Трябва обаче да се отбележи, че сегрегацията на HA се основава на изчисление на вероятността и не може да бъде определена. на донор на семейни изследвания.

Наскоро CTLp тестовете бяха въведени от много трансплантационни единици, с цел откриване на липсващи несъответствия на HLA клас I или прогнозиране на aGVHD.8 В нашия център резултатите от CTLp бяха използвани за избор на донори преди трансплантацията, а донорите с най-високи CTLp тестове бяха елиминирани . В това проучване, когато се сравняват CTLp и ДНК типизиране, високите CTLp тестове винаги са били свързани с HLA несъответствия клас I. Обаче отрицателни CTLp тестове са наблюдавани при пет двойки въпреки несъответствие на посоката на GVHD (включително три случая с HLA-A или -B несъответствие), което е в съгласие с проучването на Scott et al. Al. 11 CTLp може да бъде полезен за откриване на HLA клас I несъответствие вседопустимост. Появата на тежък aGVHD обаче при двама от четирите пациенти само с несъответствия HLA клас I и отрицателни CTLp тестове ни пречи да потвърдим тази възможност.

В заключение, геномното типизиране на HLA алеи от клас I и II значително увеличава успеха на трансплантацията от несвързани донори, със средна преживяемост в съответната група, сравнима с преживяемостта при трансплантация на гено-идентични братя и сестри. Лошата прогноза на пациенти, които са подложени на несъвместима с HLA трансплантация, предполага необходимостта от нови начини за трансплантация.