1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO DE PUNO ФАКУЛТЕТ ПО БИОЛОГИЧНИ НАУКИ ПРОФЕСИОНАЛНО УЧИЛИЩЕ ПО БИОЛОГИЯ АНТИМИКОТИЧЕН ЕФЕКТ В VITRO НА ЕТЕРИЧНОТО МАСЛО cinnamomum zeylanicum CANELA НА кандида албиканс БРЕЗЕНДАЛИН БИЗНЕСДАЛЕН БИЗНЕСЛИНДА
2 UNIVERSIDAD NACIONAL DF.L ALTIPLANO DE PUNO FACULTY O [БИОЛОГИЧНИ ЦИКЛИ rmljila ПРОФЕСИОНАЛНА ДЕ БИОЛОГИЯ В VffRO АНТИМИКОТИЧЕН ЕФЕКТ НА ЕТЕРИЧНОТО МАСЛО C1 " " "'1mum zeylanic11m/CISELJCa bIStI A l'oii.: 6r. Ol.lNl) A HU A RACHA YUCRA l'ara Ol'TAll: L TiTUW PMOFTSIONAI, ОТ: LICF.NOADO В БИОЛОКИЯ APM0BAD0 ОТ ЖУРИ РЕВИЗОМ CONFOK AOO ОТ: PRESIDLJriTE D.SC. DANTF. JONI CHOQUEHUANCA PANCU.S PRJMER MIF.MBRO SEGUNl> O WED.1 \ 1.BRO DIRECTOR I ASF.SOR Ftt - "tad6e: 02 df'mplif'mbn: dri 2019 Район: Cicn. Il, s Btomtdica.s Subject: Bio «x: oologia. Vegclal
3 ПОСВЕТЕНИЕ На Всемогъщия Бог за това, че ми е дал битие и мъдрост; Винаги ми е помагало да напредвам, по всяко време. Особено в най-трудните. Посвещавам тази работа на моите скъпи родители, Angel Flavio Huaracha Quispe и Fidela Simona Yucra Cutipa, за безусловната им помощ, подкрепата и мотивацията ми да продължа напред и да постигна целите си. На цялото ми семейство, което ме подкрепяше и винаги ми се доверяваше, с техните насърчителни думи и усмивки те ме мотивираха да продължа напред.
4 БЛАГОДАРЯ НА Националния университет на Altiplano de Puno, че ми даде възможност да оформя бъдещето си, особено на професионалната кариера на биологията и преподавателския персонал за техните знания, предоставени по време на моето професионално обучение. Изразявам специалните си благодарности на целия персонал на патологичния и клиничен лабораторен отдел на болница Мануел Нуниес Бутрон - Пуно, че ми позволи да извършвам изследователската си работа в тази институция, тъй като с тяхна помощ и принос те ми помогнаха да повиша повече знания при изпълнението на дипломната ми работа.
5 ОБЩ ИНДЕКС ОБЩ ИНДЕКС. 5 ИНДЕКС НА ФИГУРИТЕ. 7 ИНДЕКС НА ТАБЛИЦИТЕ ИНДЕКС НА АКРОНИМИТЕ РЕЗЮМЕ I. ВЪВЕДЕНИЕ Обща цел Специфични цели II. ПРЕГЛЕД НА ЛИТЕРАТУРАТА ТЕОРЕТИЧНА РАМКА Лечебни растения Етерични масла Използване на масла Техники за извличане на етерично масло Cinnamomum zeylanicum Опортюнистична микоза Candida albicans Клинични прояви Лабораторна диагностика Лечение III. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ Област на изследване Тип изследване Население и извадка Дизайн на изследване. 38
6 3.5. Методология a. Статистически анализ IV. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ V. ЗАКЛЮЧЕНИЯ VI. ПРЕПОРЪКИ VII. ЛИТЕРАТУРА VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ. 66
9 Фигура 26. Положителен контрол (флуконазол). Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари,
11 ИНДЕКС НА АКРОНИМИТЕ HMNB WHO CMI Hospital Manuel Núñez Butrón Световна здравна организация Минимална инхибираща концентрация µl Микролитри mm CMF Милиметри Минимална гъбична концентрация µg Микрограми ml cm Милилиметри Сантиметри µm Микрометри C Градуси Celcius ECM KOH ASD kg Матрица Кислот Матрица Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Матрица Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Кислот Матрица Кислот Кислот Кислот Кислот Матрица Матрица Единици за формиране на колонии
16 1.1. Обща цел Да се оцени противогъбичната активност in vitro на етеричното масло от cinnamomum zeylanicum върху Candida albicans Специфични цели Да се сравни инхибиторният ефект in vitro на най-добрата инхибиторна концентрация на етеричното масло от Cinnamomun zeylanicum и антибиотика флуконазол върху Candida albicans. Определете минималната инхибиторна концентрация (MIC) на етеричното масло Cinnamomum zeylanicum канела при концентрации 25%, 50%, 75% и 100% върху Candida albicans. Хипотеза Етеричното масло от Cinnamomum zeylanicum канела показва инхибиторен ефект in vitro върху щамовете Candida albicans. Възможно е да се определи минималната инхибиторна концентрация (MIC) на етеричното масло от канела при концентрации 25%, 50%, 75%, 100%. 16.
24 Дестилация след мацерация Този метод се използва за извличане на маслото от лукови луковици, бадемови семена, луковици чесън и листа от бреза. От друга страна, ароматните растения трябва да бъдат подложени на процес на мацерация с гореща вода, за да подпомогнат отделянето на маслото, тъй като летливите му съединения са свързани с гликозилирани компоненти (Albarracín & Gallo, 2003). Фигура 2. Водно-парна дестилация или влажна пара (Vidal, 2015) Cinnamomum zeylanicum Cinnamon принадлежи към семейство Lauraceae, от рода Cinnamomum, който има приблизително 250 вида, трите най-важни сорта, от които се извлича канелено масло, са C. zeylanicum, C. cassia Blume и C. camphora L (Sanchez, 2013). Канелата има биологични ефекти като аналгезия, тя е антисептична, спазмолитично, афродизиачно, стягащо, карминативно, хемостатично, инсектицидно и паразитицидно (González, 2010). Синонимия Общо име: Цейлонска канела, канела, канелони (Aizaga, 2017). Немски: zimt Английски: канела Италиански: cannella Каталунски: canyella Баски: kanelondo Гало: caneleiro 24
26 Шриланкийската канела е любимата на европейците, тъй като е по-мека, има сладък вкус и е по-скъпа (Откровение, 2017). Таксономична класификация Кралство: Plantae Раздел: Magnoliophyta Клас: Magnoliopsida Ред: Laurales Семейство: Lauraceae Род: Cinnamomum Видове: Cinnamomum. zeylanicum Общо наименование: Канела Източник: (Aizaga, 2017) Химичен състав на канеленото масло Когато споменаваме химичния състав на канеленото масло, ние се позоваваме на компонентите, които кората представя, която канелата представя (aizaga, 2017), където количествата химични вещества най-вече съответстват на канелен алдехид, евгенол, феландрен, линалоол, бензалдехид, кариофилен, бензоена киселина и бензил цинамат ((Luis, 2017), можем да споменем и вещества, които се съдържат в по-малки количества като: танини, кумарин, захари и смола, също откривайки нишесте, слуз, танинова киселина, минерални материали и флавоноиди, като едно от тези вещества е това, което съответства на осигуряването на противогъбичен ефект (padrón, 2010) Таблица 1. Компоненти на канелата Източник: (Sanchez, 2013; (Brand, 2013) 26
27 Химическа структура Структура на някои компоненти на канелата (Cava, 2013) Цинамалдехид Евгленол Катехин Поцианидин Сафрол Механизъм на действие По начина, по който действа канеленото масло, е в индуцирането на апоптоза, причиняваща клетъчна смърт, следователно, това генерира некроза чрез процес чрез на които се нарушава митохондриалната функция на клетките на дрождите, за което това ще доведе до увеличаване на пропускливостта и елиминиране на йони от мембраната на чувствителната гъбична клетка. Дори е доказано, че канелата в различни ракови клетки има цитотоксична активност ((Aizaga, 2017). Индукционният ефект може да продължи до 24 часа след излагане. Това засяга повече дрожди, отколкото бактерии; без обаче, ако противопоставим нейните ефекти с тези на други масла канелата има по-голяма противогъбична активност (Sanchez & Luján, 2013). 27
31 цитоплазмата има инвагинации като канали с дебелина от 200 до 300 mm, където представя 2 отделения със стероиди и протеини, освен това се контролира пропускливостта на клетките и синтеза на клетъчната стена, което е много важно, тъй като лекарствата (антибиотици и противогъбични средства) използвани за противодействие, те действат на това ниво. Той също така съдържа ензими, които са отговорни за синтеза на клетъчната стена, поради което, когато лекарството действа върху цитоплазматичната мембрана, автоматично намалява синтеза на клетъчната стена (Aguilar, 2016). Клетъчна стена на гъбички. Показани са припокриващите се елементи от манан, глюкани, хитин и протеинови елементи. Протеините, които образуват комплекси с манан (манопротеини) се простират отвъд клетъчната стена. Фигура 3. Клетъчна стена на гъбички от дрожди, показва суперпозицията на елементи от манан, глюкани, хитин и протеинови елементи. Източник: Микробиология (Ryan, 2012). 31
33 2. Повърхностна инфекция: проникването на епител е важно на този етап чрез разграждане на белтъците гостоприемници чрез хидролитични ензими и образуване на хифали. 3. Дълбока инфекция: проникване в тъканите, съдова инвазия и имунно избягване чрез хидролитични ензими, както и образуването на хифи. 4. Дисеминирана инфекция: Candida albicans се осъществява чрез прилепване към ендотел, инфекция на тъканите гостоприемници, активиране на коагулационната система чрез намеса на адхезини, хидролитични ензими, образуване на хифи отново и промяна на фенотипа. Проучванията in vitro при животни и хора са замесени с протеази като (De la Calle et al, 2012): Фигура 4. Етапи на инфекция от Candida albicans и механизмите на вирулентност, участващи във всеки етап (De la Calle et al. Al, 2012). 33
37 III. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 3.1. Изследвания район Проби от канелена кора са получени в Jr. Lima N 231 Близо до пазара Санта Барбара в град Джулиака сутринта в сектора за подправки. Получаването на етеричното масло от канела, Cinnamomum zeylanicum, се извършва в лабораторията за плодове и зеленчуци на Професионалното училище по агроиндустриално инженерство на Националния университет в Алтиплано. Щамът Candida albicans е получен от регионалната болница Manuel Núñez Butrón Puno. Противогъбичният ефект на етеричното масло от канела Cinnamomum zeylanicum върху щамовете на Candida albicans е осъществен в Службата по клинична патология на регионалната болница Manuel Núñez Butrón, район за микробиология на град Пуно (Фигура 6). Фигура 6. Район на извличане на етеричното масло от канела и изпълнение на разследването (болница Manuel Núñez Butrón) Пуно, през месеците ноември 2018 г. до февруари
39 Таблица 2. Изследователски проект за сравнение на in vitro инхибиторния ефект на най-добрата инхибиторна концентрация на етеричното масло от Cinnamomun zeylanicum и антибиотика флуконазол върху Candida albicans. Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 до февруари на За да определим противогъбичната активност, работихме с 30 експериментални единици, съставени от 5 повторения за всяка използвана доза, в допълнение положителна контрола е използван търговският антибиотик флуконазол и алкохол за отрицателен контрол за Candida albicans. По такъв начин, че те служат за противопоставяне на инхибиращия ефект, тъй като вече е известно, че споменатите микроорганизми са чувствителни към тези антибиотици. Таблица 3. Дизайн на експеримента, концентрации и брой повторения за намиране на минималната инхибираща концентрация (MIC). 39
47 Farland (Фигура 16), приготвеният инокулум се засява с помощта на тампон със стриатум върху плочите, съдържащи се Saboraud Dextrose Agar плюс канелено етерично масло, приготвено в различни концентрации или дози канелено масло 100%, 75%, 50%, 25 %, 12,5%, 6,25% и 3,125% съответно, паралелно се поставя контролна плака без никаква концентрация на масло без обработка (контрол на растежа). Инкубацията се извършва в продължение на 24 часа, след инкубацията плочите се изследват за развитие, за да се демонстрира към коя минимална инхибиторна концентрация (MIC) Candida albicans показва чувствителност. Не са използвани статистически тестове. 47
56 V. ЗАКЛЮЧЕНИЯ Най-добрият ин витро инхибиторен ефект на етеричното масло от канела Cinnamomun zeylanicum е получен при концентрация 100% (Обработка Т4) с инхибиращ ореол от mm, което представлява статистически значима разлика в сравнение с другите лечения с по-ниски концентрации. По същия начин няма статистически значима разлика в сравнение с контролата с флуконазол противогъбично средство, което получава инхибиращ ореол от mm. За минимална инхибиторна концентрация (MIC) на етеричното масло от Cinnamomum zeylanicum канела, при концентрации 25%, 50%, 75% и 100% върху Candida albicans. Това е 25% от етеричното масло от канела, което би било най-ниската концентрация, с която вече се проявява инхибиторният ефект, тъй като не се наблюдава растеж на гъбички. 56
57 VI. ПРЕПОРЪКИ Извършете изследвания, проверяващи противогъбичната активност на етеричното масло от Cinnamomun zeylanicum канела срещу различни лекарства от терапевтичен интерес, при лечението на състояния, причинени от кандидоза. Продължете с проучването на етеричното масло от канела (Cinnamomum zeylanicum) поради неговата противогъбична активност срещу растежа на Candida albicans, с проучвания при пациенти; in vivo проучване. Да продължи с изследванията на противогъбични продукти, присъстващи в етерични масла от различни растения, с цел насърчаване на разследването на лечения, базирани на естествени продукти. Пригответе различни фармацевтични форми според начина на приложение, като използвате Cinnamomun zeylanicum (канела) етерично масло за клинични изпитвания при пациенти с дерматоза Candida albicans. Проведете повече изследвания на етеричното масло от канела, за да можете да го използвате в бъдеще в клинична дейност като възможно лечение. 57
66 ПРИЛОЖЕНИЕ А VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ Фигура 8. Кора от Cinnamomum zeilanicum (канела), придобита в град Джулиака, ноември Фигура 9. Претегляне на канелената кора. Лаборатория за цехове за плодове и зеленчуци, ноември Фигура 11. Смилане на кора от канела в лабораторията за работилница за плодове и зеленчуци, ноември Фигура 10. Екстракция на етерично масло от канела по метода на влачене с пара. В лабораторията за размери на плодове и зеленчуци, ноември
67 Фигура 12. Декантиране на канелено масло в лабораторията на Taller de Frutas y Vortalizas, ноември 2018 г. Фигура 13. Получаване на етерично масло от канела в лабораторията на Taller de Frutas y Vegetables, ноември, 2018 г. Фигура 14. Концентрация на масло канела основни 100 %, 75%, 50%, 25%, положителна контрола (флуконазол) и отрицателна контрола (алкохол), Клинична патологична служба на Регионална болница Мануел Нунес Бутрон, район за микробиология, ноември 2018 г. до февруари 2019 г. Фигура 15. Изолация на Candida albicans щамове, Служба за клинична патология на Регионална болница Мануел Нунес Бутрон, район Микробиология, ноември 2018 до февруари,
68 Фигура 16. Подготовка на скалата на Mc Farland. Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари, Фигура 17. Наблюдение на Candida albicans при 40x, Клинична служба по патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците от ноември 2018 г. до февруари,
69 Фигура 18. Обработка на проби за метода на зародишна тръба, Клинична патологична служба на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари 2019 г. Фигура 19. Наблюдение на микроскоп при 40 x за Candida albicans, Клинична патологична служба на регионалната болница Manuel Núñez Butrón, област Микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари,
70 Фигура 20. Ореол на инхибиране при концентрация 50%. Служба за клинична патология на регионалната болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари, Фигура 21. Инхибиране на Halo при концентрация от 75%. Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари,
71 Фигура 22. Ореол на инхибиране при 100% концентрация. Служба за клинична патология на регионалната болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари 2019 г. Фигура 23. Инокулация на щамове Candida albicans в Saboraud Dextrose Agar. Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари,
72 Фигура 24. Ореол на инхибиране при концентрация 25%. Служба за клинична патология на регионалната болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари 2019 г. Фигура 25. Отрицателен контрол (алкохол). Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари,
73 Фигура 26. Положителен контрол (флуконазол). Служба за клинична патология на Регионална болница Manuel Núñez Butrón, микробиология, през месеците ноември 2018 г. до февруари,