трика

Молекулярна биология, Протеини

Пет практически трика, за да бъдеш експерт в Western Blot

Western blot (WB) все още е най-широко използваният метод за разделяне и откриване на протеини днес и въпреки това все още е досадно да се налага да се прецизира всеки експеримент. Оптимизирането на нашия експеримент е от решаващо значение и фактори като: качеството на антитялото, блокиращите буфери или ефективността при трансфера са ключови стъпки за успех в процеса.

Ще анализираме подробно какви съвети и инструменти ще ни позволят да подобрим резултатите си.

1. Заредете точното количество протеин

Количеството протеин, което трябва да се зареди във всяка ямка, е променлива и той трябва да бъде оптимизиран от изследователя, тъй като това е фактор, който зависи от нива на изразяване на този ген в тази тъкан. Освен това трябва да се вземе предвид какъв обем на пробата признава тази чаша. Въпреки това, между 10 Y. 50 ug протеин от тъканния хомогенат и между 10 Y. 100 нг общият протеин в пречистени проби обикновено е достатъчен.

2. Трябва ли моите проби да бъдат намалени или денатурирани?

Прегледът на техническия лист с антитела е от съществено значение, за да знаем как трябва да подготвим нашите проби. Обикновено пробите за WB са протеини денатуриран. Нативните протеини имат третична структура и тяхната конформация дава основна роля в функция на протеин. Тази структура обаче ще повлияе на миграция от тези протеини чрез порите полиакриламид. Денатурацията на протеини може да се извърши чрез:

  • Натриев додецил сулфат (SDS), е детергент, използван за разкъсване на водородни връзки и разглобяване на третичната структура.
  • Редуциращи агенти като b-меркаптоетанол или дитиотреитол (DTT) за намаляване на дисулфидните мостове между цистеините.
  • Топлина пробите до 100ºC за денатуриране и улесняване на свързването на SDS.


3. Как да избегнем страховитите „усмихнати“ групи и „петна“ ?

Ако нашата мембрана представя тези „усмихнати ленти“, вероятно е трябвало да се извърши електрофорезата твърде бързо или пробите са станали твърде горещи. Препоръчва се още една миграция бавен по време на повече време и ако е възможно в студ.

Понякога те могат да се появят петна бяло в нашето петно ​​в резултат на мехурчета въздух, задържан по време на процеса на трансфер. За да избегнете този досаден проблем, препоръчваме да използвате 50 ml конична тръба върху трансферния комплект с идеята за отървавам се от остатъчният въздух между полиакриламидния гел и нитроцелулозната или PVDF мембраната.

4. Има ли разлика между блокиране с BSA или мляко?

След прехвърляне на протеина от полиакриламидния гел в мембраната той е от съществено значение блокират онези точки на мембраната, които не съдържат лиганд, за да намаляване фона или неспецифичното свързване на антитялото с мембраната.

За нас е повече препоръчително следвайте съветите, посочени от производителя, тъй като обикновено антителата могат да бъдат много чувствителен вида на използвания блокиращ агент.

По принцип блокирането с говежди серумен албумин (BSA) осигурява по-ясни резултати, тъй като този протеин има по-ниска кръстосана реактивност. В допълнение, използването на BSA е показано в онези петна, в които искаме да открием протеини фосфорилиран.

С много антитела обаче се работи по-добре мляко обезмаслено, тъй като съдържа голямо разнообразие от блокиращи агенти.

5. Какво разреждане на първичното антитяло трябва да използвам?

Оптималната концентрация на антитяло е тази, чрез която получаваме добър сигнал с минимален фонов шум. Очевидно е, че за да спестите пари, е идеално да разреждаме нашето антитяло, стига сигналът да е адекватен.

Но с нови антитела е подходящо да се направи банка за разреждане, за да се знае кое е разреждането, което най-добре се адаптира към този протеин в тази тъкан. Например, ако производителят предложи разреждане 1: 200, можем да тестваме разреждания 1:50, 1: 100, 1: 500 или дори 1: 1000.

В случай, че нямаме допълнителна информация за разреждането, което ще използваме, можем да се ориентираме според следните параметри:

  • супернатант от клетъчна култура: приблизително 1:10
  • асцит: 1: 100
  • общ антисерум: от 1:50 до 1: 100
  • пречистено антитяло: 5 ug/mL

Консултирайте се с всички решения за Western blot, които Labclinics ви предлага

Genetex Ви предлага селекция от продукти, свързани с Western Blot (електрофореза, трансфер, блокиране и др.).