терапевтично

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Ретигабинова модулация на KCNQ канали чрез Trp S5
  • Неестествена аминокиселинна мутагенеза на канали KCNQ3
  • Загуба на ретигабинови ефекти след отстраняване на Trp265 H връзка
  • Фина настройка на силата на взаимодействието Trp265-ретигабин
  • Относителен принос на предполагаемите остатъци, свързващи лекарства.
  • Идентифициране на вероятен Н-свързващ донор в ретигабин
  • Дискусия
  • Методи
  • Молекулярна биология и in vivo потискане на глупости
  • Записи на двуелектродна скоба за напрежение
  • Молекулярни симулации на свързване на ретигабин
  • Анализ на данни
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

  • Йонни канали
  • Мембранни протеини
  • Молекулярна биофизика

Обобщение

Въведение

Епилепсията е често срещано, хетерогенно и често инвалидизиращо разстройство, което засяга приблизително 1% от населението на света. Настоящото клинично лечение на пациенти, страдащи от епилепсия, се извършва главно чрез медикаменти, въпреки че е общоприето, че ∼ 30% от новодиагностицираните пациенти с епилепсия ще бъдат резистентни към често срещаните антиконвулсанти 1, 2. Освен това споменатото съпротивление е свързано с вида на атаката; например, съобщено е, че 60% от пациентите с фокална епилепсия ще развият и поддържат лекарствена резистентност 3. Тези недостатъци са мотивирали търсенето на нови антиепилептични лекарства, неконвенционални лечения за епилепсия (като кетогенната диета) и непрекъснатото идентифициране и валидиране на нови фармакологични цели 4, 5, 6, 7 .

Използвали сме неестествена аминокиселинна мутагенеза, за да пренаредим атомите и електроните от страничната верига Trp на мястото на свързване на ретигабина. Нашите открития показват, че повторното позициониране на индолния азотен атом на KCNQ3 Trp265 напълно елиминира ефектите на ретигабина, което предполага, че взаимодействието на ретигабина изисква образуването на Н връзка с Trp265. Важността на това взаимодействие с H-връзка се илюстрира допълнително чрез въвеждането на флуорирани Trp аналози (с по-висока склонност към H-връзки) в KCNQ3 Trp265, което води до повишена сила на лекарството. Използвайки множество аналози на ретигабин, ние идентифицирахме електростатичен пръстов отпечатък около акцептор на Н-връзка, който корелира с ефикасността на лекарството. Тези експериментални ограничения идентифицират специфични атоми и химични сили, участващи в ретигабиновите взаимодействия, и подчертават подходи, които могат да бъдат използвани за насочване на рационалното подобряване на съществуващите лекарства.

Резултати

Ретигабинова модулация на KCNQ канали чрез Trp S5

( да се, б ) Проводимост-напрежение за ( да се ) KCNQ2 (n = 3) и KCNQ2 [Trp236Phe] (n = 6), и ( б ) KCNQ3 * (n = 5) и KCNQ3 * [Trp265Phe] (n = 3) хомомерни канали заедно с посочените мутанти (концентрация на ретигабин от 100 цМ). ( ° С ) Проводимост-напрежение за хетеромерни комбинации от KCNQ2 и KCNQ3 (съотношение 1: 1 на инжектирана иРНК, със или без Trp → Phe мутации, както е посочено, n = 5 за всяка комбинация), използвани за генериране на канали с намален брой на свързване на ретигабин сайтове. ( д ) Обобщение на V 1/2 промени в 100 μM насищане на ретигабин за мутации KCNQ2 Trp236 и KCNQ3 Trp265, както е посочено (* P 19, 20 .

Тествахме дали позицията KCNQ3 Trp 265 играе роля при регулирането на реакциите на канала към PIP 2. Използвайки чувствителната към напрежение фосфатаза ciona intestinalis, чувствителна към напрежение фосфатаза (CiVSP), за да хидролизираме PIP 2 до деполяризирани напрежения, пулсирахме ооцити чрез набор от предварителни импулсни напрежения, последвани от -20 mV тестов импулс за оценка на активността на канала след изчерпване на PIP 2 27 . Наблюдавахме подобно намаляване на канала с стъпки на деполяризационно напрежение в каналите KCNQ3 * и KCNQ3 * [Trp265Phe], което показва, че Trp265 не оказва значително влияние върху ефектите на анионните фосфолипиди върху функцията на канала (Фиг. 1д, f). Като цяло тези открития илюстрират, че остатъкът KCNQ3 Trp265 е от съществено значение за ефектите на ретигабина, но не играе съществена роля в регулирането на активирането на канала чрез напрежение или PIP 2. .

Неестествена аминокиселинна мутагенеза на канали KCNQ3

За да изследваме основния механизъм на взаимодействията на ретигабина с тази съществена странична верига на Trp, използвахме неестествена аминокиселинна мутагенеза, за да въведем леко променени варианти на Trp (Фиг. 2а). С този метод стоп кодон (TAG) се поставя в гена на йонния канал на място, което представлява интерес, и тази иРНК се инжектира съвместно в ооцитите на Xenopus laevis заедно със синтетична аминокиселинна ацилирана tRNA (носеща не-аминокиселина естествен), който е ортогонален на синтетичните ксенопус тРНК 28 пътища. Когато машината за транслация на рибозома срещне въведения TAG стоп кодон, комплементарната синтетична тРНК (с антикодон CUA) позволява добавената аминокиселина да бъде отчетена и включена в йонни канали с пълна дължина (фиг. 2а) 29 .

Загуба на ретигабинови ефекти след отстраняване на Trp265 H връзката

Относителен принос на предполагаемите остатъци, свързващи лекарства.

( да се ) Съотношенията проводимост-напрежение бяха събрани за посочените мутантни канали KCNQ3 * (n = 4-6 на мутант), в 0, 100 или 300 цМ ретигабин. ( б ) ΔV 1/2 максимум в 300 μM ретигабин, измерен във всеки мутант канал. Лентите за грешки в да се, б представляват sem ( ° С ) Ретигабинът е свързан с молекулярен модел на порообразуващия домен на KCNQ3 (вж. Справка 19). Показани са две ориентации с карбаматната група в близост до Leu314 („оригинален“ модел) или Trp265 („флип“ модел). Двата модела на свързване се припокриват в „наслагването“, показвайки сходното пространство, заето от двете лекарствени ориентации.

Изображение в пълен размер

Идентифициране на вероятен Н-свързващ донор в ретигабин

По-нататък изследвахме механизма на H-свързване с Trp265 чрез търсене на потенциални акцептори на H-връзка върху молекулата на ретигабин, задача, улеснена от наличието на множество аналози на ретигабина. Първо разглеждаме аналога ML-213, тъй като той има опростена химическа рамка в сравнение с ретигабин и намален брой възможни акцептори на Н връзка (Фиг. 6а, б). Установихме, че ML-213 е по-мощен активатор на KCNQ3 * в сравнение с ретигабин (EC 50 = 3,6 ± 0,2 μM, n = 5, срещу 11,6 ± 0,4 μM, n = 5, съответно, фиг. 6в, ± посочено е) . Ние също така включихме изчислените електростатични повърхностни потенциали за ретигабин и ML-213, илюстрирайки, че отрицателният повърхностен потенциал около карбонилния кислород е по-изразен за ML-213 (червен бум, фиг. 6а, б).

( да се, б ) Химични структури и електростатични повърхностни потенциали за ретигабин и ML-213. Обърнете внимание на потенциалното отрицателно увеличение на повърхността в близост до карбонилния кислороден атом в ML-213. Скалата за представяне на електростатичния повърхностен потенциал е червена: -80 kcal, жълта: 0 kcal, синя: +80 kcal. ( ° С ) Криви на концентрация-отговор за ефектите на ретигабин и ML-213 (n = 5) върху KCNQ3 * канали (n = 5). Лентите за грешки представляват sem

Изображение в пълен размер

( да се ) Химични структури и електростатични повърхностни потенциали за серия от аналози на ретигабин. Всички структури и карти на повърхностния потенциал са подравнени въз основа на местоположението на запазената амидно-естерна връзка; Наблюдавайте градиента на интензитета на отрицателния повърхностен потенциал около карбонилния кислороден атом (скалата е същата като на фиг. 6). ( б ) Обобщение, илюстриращо EC50 на всяко лекарство в спасени с Trp KCNQ3 * [Trp265TAG] канали, F 3 -Trp-спасени и Ind-спасени (n = 4-9 на точка от данни), и максимална ефикасност (ΔV 1/2) на всяко лекарство в спасените канали F 3 -Trp и Trp (ефектите върху спасените от Ind канали са минимални и следователно са пропуснати). Лентите за грешки представляват sem

Изображение в пълен размер

Дискусия

Понастоящем ретигабинът е единственото лекарство, широко одобрено за клинична употреба, което действа чрез активиране на калиеви канали с напрежение 35. Подробното разследване на този прототип на лекарството може да задълбочи нашето разбиране за това как лекарствата могат да действат като активатори на йонни канали и да ускорят развитието на активатори на калиеви канали с по-висока сила или специфичност. Тези лекарства могат да имат неизползван терапевтичен потенциал за лечение на различни нарушения на „свръхвъзбудимост“ в допълнение към епилепсията, като синдроми на болката, хипертония и сърдечни аритмии 9, 36. Освен това последните доклади подчертават ефективността на ретигабина при лечението на шум в ушите, болестта на Паркинсон и болестта на Хънтингтън 37, 38, 39 .

В началото на нашето проучване, химерни проучвания с нечувствителния към ретигабин канал KCNQ1 установиха значението на остатък Trp (KCNQ3 Trp265) в пореобразуващия регион, близо до предполагаемата порта на цитоплазмения канал. Взаимодействията на ретигабин с този сайт бяха рационализирани като общи хидрофобни взаимодействия с този консервиран остатък Trp (присъстващ и в KCNQ2, 4 и 5) 19, 20 .

Представени са множество структури за отваряне на канали KCNQ, за да се подчертаят общите характеристики на амидна група, фланкирана от различни пръстеновидни структури. Нашите открития подчертават значението на амид карбонила за взаимодействието с KCNQ3 Trp 265 и вероятните еквивалентни позиции в KCNQ2, 4 и 5. Представените лекарства са ( да се ) ретигабин, ( б ) ztz-240 (описано в справка 24), ( ° С ) акриламид (и) -1, ( д ) BMS-204352 и ( и ) неназовано експериментално лекарство, описано в реф. 43)

Изображение в пълен размер

Една последна забележителна подробност е, че въпреки че нашите открития очертават атомна основа за взаимодействието на ретигабин с KCNQ3 Trp265 (и аналогични остатъци в KCNQ2, 4, 5), има значителни доказателства за допълнителни места за взаимодействие, които позволяват потенцирането на някои KCNQ субединици. Например, съобщено е, че тестваните ICA съединения (и други сродни съединения като ztz-240), заедно с фамилия производни на диклофенак, влияят на каналите KCNQ2 независимо от запазения остатък S5 Trp и показват драстично по-силни ефекти върху KCNQ2. връзка с KCNQ3 (препратки 22, 24, 25, 30). Освен това несвързаните KCNQ отварящи устройства, като цинков пиритион, изглежда не зависят от взаимодействието на водородната връзка, което сме идентифицирали в това проучване 48 Следователно, непрекъснатото изследване на свързването на лекарството с различни подтипове на KCNQ канал може да помогне да се разкрият допълнителни места за подобряване на KCNQ.

В заключение използвахме неестествена аминокиселинна мутагенеза и налични аналози на ретигабин, за да локализираме ефектите от свързването на ретигабин с едно взаимодействие с Н-връзка с KCNQ3 Trp265. Тези открития подчертават необичаен начин на лекарствено взаимодействие със странична верига Trp и демонстрират важността на внимателното изследване на механизма на лекарствените взаимодействия, за да се насочи рационалната модификация на терапевтичните съединения.

Методи

Молекулярна биология и in vivo потискане на глупости

Флуорирани производни на Trp (5-F 1 -Trp; 7-F 1 -Trp; 5, 7-F 2 -Trp (F 2 -Trp) и 5, 6, 7-F 3 -Trp (F 3 -Trp) бяха закупен от Asis Chem (Watertown, MA) и Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Вариантът "Ind" Trp е синтезиран вътрешно, както е описано по-рано 31, 50. Извършено е включване на неестествени аминокиселини в протеини на йонни канали както е описано подробно в предходни публикации 29, 34, 51. Накратко, неестествените аминокиселини (aa) са защитени с нитроветратрилоксикарбонил и са активирани като цианометилов естер, които след това са свързани с динуклеотид pdCpA (GE Healthcare/Dharmacon, Lafayette, CO) Впоследствие този аминоацил динуклеотид е лигиран към модифицирана (G73) Tetrahymena термофилна тРНК. Аминоацилираната тРНК-аа е премахната с ултравиолетово облъчване непосредствено преди инжектирането на ооцити. В типичен експеримент 80 ng tRNA-aa и 40 ng KCNQ3 сРНК се инжектират в обем от 50 nl. В контролни експерименти само сРНК или сРНК заедно се инжектира тРНК, свързана с pdCpA, но без добавена аминокиселина (тези паралелни контролни експерименти се провеждат всеки експериментален ден и резултатите са описани в целия текст).

Записи на двуелектродна скоба за напрежение

Калиевите токове, захванати с напрежение, са записани в стандартен разтвор на Рингерс (в mM): 116 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 5 HEPES (pH 7.4) с помощта на OC-725C скоба за напрежение (Warner, Hamden, CT) . Стъклените микроелектроди се запълват с 3 M KCl и имат съпротивления от 0,1–1 MΩ. Данните бяха филтрирани при 5 kHz и цифровизирани при 10 kHz с помощта на Digidata 1440A (Molecular Devices), контролиран от софтуера pClamp 10 (Molecular Devices). Лекарствата са закупени от Toronto Research Chemicals (ретигабин) или Tocris (ML-213, флупиртин, ICA-069673, ICA-110381), съхранявани като 100 mM запаси в диметилсулфоксид и разредени до работни концентрации всеки експериментален ден.

Молекулярни симулации на свързване на ретигабин

Анализ на данни

Зависимостта на напрежението на активирането на канала е оборудвана със стандартно еднокомпонентно уравнение на Болцман от вида G/G max = 1/(1 + e− (V_V1/2)/k, където V 1/2 е напрежението, при което каналите показват половин максимален активиране и k е коефициент на наклон, отразяващ обхвата на напрежението, в който се наблюдава е-кратна промяна в Po. За генериране на криви на реакция на концентрация - реакция към ретигабин и производни, Δ V 1/2 (изместването на напрежението на полуактивиране) се нормализира до максималното наблюдавано Δ V 1/2 и се вписва в следното уравнение: нормализира се Δ V 1/2 = 1/(1 + EC 50/[лекарство]). Статистическите тестове и значимостта са описани във фигурните легенди в целия текст.

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Допълнителна таблица 1

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки. Ако откриете нещо злоупотребяващо или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.