Университет в Гранада Официална докторска програма по биомедицина Биохимична и функционална характеристика на транскрипционния и сплайсинг фактор PRPF40B Soraya Becerra Ortiz López-Neyra Гранада Институт по паразитология и биомедицина, 2015 г.

фактора

Издател: Университет в Гранада. Докторска дисертация Автор: Soraya Becerra Ortiz ISBN: 978-84-9125-072-2 URI: http://hdl.handle.net/10481/40006

Докторантът SORAYA BECERRA ORTIZ и директорът на дисертацията CARLES Mª SUÑÉ NEGRE, озаглавен БИОХИМИЧНА И ФУНКЦИОНАЛНА ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НА ФАКТОРА ЗА ПРЕПИСВАНЕ И СПЛИЦИРАНЕ PRPF40B: Гарантираме, подписвайки тази докторска дисертация, че работата е извършена от докторанта под посоката на директора на дипломната работа и доколкото знанията ни достигат, при извършването на работата са спазени правата на други автори, които трябва да бъдат цитирани, когато са използвани техните резултати или публикации. Гранада, 28 януари 2015 г. Директор на докторската дисертация Подписано: д-р Carles Mª Suñé Negre Подписано: Soraya Becerra Ortiz

функционални анализи, ние показваме, че PRPF40B също е способен да активира транскрипцията. Ние също така показахме, че мутациите, свързани с миелодиспластичния синдром, драстично намаляват способността за транскрипционно активиране на PRPF40B.

I. СЪКРАЩЕНИЯ 1 II. ВЪВЕДЕНИЕ 7 1. ИЗРАЗЯВАНЕ НА ГЕНИТЕ. ТРАНСКРИПЦИЯ 9 1.1 РНК полимераза 9 1.2 RNAPII CTD 9 1.3 Етапи на транскрипция 10 1.3.1 Иницииране 10 1.3.2 Удължаване 10 1.3.2. Прекратяване 11 1.4 Регулиране на транскрипция 12 2. ОБРАБОТКА НА мРНК 14 2.1 Сплицеозома 14 2.2 Определение на екзон 16 2.3 Алтернативно сплайсинг 17 2.4 Видове алтернативно сплайсинг 18 3. РЕГУЛИРАНЕ НА СПЛИЦИРАНЕ 19 3.1. Cis регулаторни елементи 19 3.2. Регулаторни елементи в транс 19 3.3 Регулаторни механизми на сплайсинг 22 4. ТРАНСКРИПЦИОННО СЪЕДИНЯВАНЕ И СПЛИЦИРАНЕ 25 4.1 Кинетичен модел 25 4.2 Модел за набиране 28 4.2.1 Транскрипционни и сплайсинг коефициенти на свързване 29 4.2.2 Протеини с WW домейни и FF 31 5. ЯДРАТА НА ЕВХАРИЙСКАТА КЛЕТКА 38 5.1 Ядрени петънца 39 5.1.1 Функция на ядрените петънца 40 5.1.2 Състав на ядрените петънца 41 5.1.3 Сигнализиращи домейни към ядрените петънца 42 6. АПОПТОЗА 44 6.1 Външен път 45

6.2 Вътрешен път 45 6.3 Каспази 46 7. АПОТОЗА И СПЛИЦИРАНЕ 48 7.1 Регулиране на фаса 49 8. АЛТЕРНАТИВНО СПЛИЦИРАНЕ И ЗАБОЛЯВАНЕ 51 8.1 Видове промени в сплайсинга 51 8.2 Алтернативно сплайсинг и нервната система 52 8.3 Алтернативно сплайсинг при рака 54 III. ЦЕЛИ 57 IV. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 61 1. ПЛАЗМИДИ 63 2. КЛЕТНИ КУЛТУРИ И ПРЕОБРАЗОВАНИЯ 65 2.1 Клетъчни култури 65 2.2 Трансфекции 66 2.3 Инфекция на клетъчни култури 67 3. ПРОЦЕДУРИ НА МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЯ 68 3.1 Имунофлуоресценция 68 3.2 Екстракция на РНК и RT-PCR 69 3.3 Екстракция на обща РНК за масивен анализ 71 3.4 Насочена мутагенеза на PRPF40B 72 3.5 Анализи за активност на луцифераза 72 3.6 Тестове за взаимодействие между протеини и протеини in vivo 73 3.7 Анализи за взаимодействие между протеини и протеини in vitro 74 4. ПРОЦЕДУРИ НА КЛЕТЧНА БИОЛОГИЯ 74 4.1 Анализи на клетъчна смърт и клетъчен цикъл 75 4.2 Анексин Анализ на V свързване 75 4.3 Измерване на активността на каспаза-3 75 4.4 Анализ на експресия на мембранен рецептор Fas/CD95 76

2. Характеризиране на структурни елементи, необходими за местоположението на PRPF40B 154 3. PRPF40B взаимодейства със сплайсосомни компоненти SF1 и U2AF 65 156 4. PRPF40B модулира алтернативно сплайсинг 157 5. PRPF40B участва в процеса на апоптоза 159 6. PRPF40B се изразява диференцирано в нервната тъкан и функционира като активатор на транскрипция 159 7. Влияние на PRPF40B в AML 162 8. Прилики и разлики между PRPF40A и PRPF40B 164 9. PRPF40B като съединител на процеси на транскрипция и сплайсинг 165 VIII. БИБЛИОГРАФИЯ 169

Съкращения Rev обратни RLU относителни светлинни единици RNAPII РНК полимераза II RRM РНК мотив за разпознаване, РНК мотив за разпознаване s втори SEM стандартна грешка на средната Ser2 серин 2 Ser5 серин 5 SF1 Фактор на сплайсинг 1 SMA спинална мускулна атрофия, спинална мускулна атрофия snornps малък нуклеоларен рибонуклеопротеин, малки ядрени рибонуклеопротеини SNP еднонуклеотиден полиморфизъм SRE сплайсинг регулаторни елементи, сплайсинг регулаторни елементи TCERG1 Регулатор на удължаване на транскрипцията 1 Th4 треонин 4 TIA-1 T-клетъчен вътреклетъчен антиген-1 TNFR тумор некротичен фактор рецептор, тумор некрозис фактор рецептор TSS начална страница на транскрипция TSS snrnp богат на уридин малък ядрен рибонуклеопротеин U2AF U2 snrnp спомагателен фактор URE6 богат на уридин екзоник 6 елемент URI6 богат на уридин интронен 6 елемент WB Western blot WT див тип/див XIAP X-свързан инхибитор на апоптоза YBX3 Y кутия свързващ протеин 3 5

Въведение Фигура I-2. Реакция за сглобяване и сплайсинг. Схематична диаграма на образуването на всеки комплекс (E, A, B, C) по време на етапите на сглобяване на сплайцозомата. Представени са субединиците snrnps U1, U2, U4, U5 и U6; както и коефициентите на сплайсинг SF1 и U2AF. 3 SS, място за снаждане 3 (GA); 5 SS, място за снаждане 5 (GU); BPS, точка на разклонение (A); Py, полипиримидинов тракт; ED, дефиниция на екзона. 2.2 Определение на екзона Набирането на фактори от двете страни на интрона по време на първоначалното сглобяване на сплайцозомата не се случва независимо, но между тях има комуникация, която улеснява взаимното разпознаване на 5 SS и 3 SS места. Въпреки това, големият размер на интроните в сравнение с дължината на екзоните, кара тази връзка да се осъществява чрез взаимодействия, опосредствани по протежение на екзона в процес, известен като дефиниция на екзон (Berget, 1995). На следващо място, дефиницията на интрона се осъществява чрез взаимодействия, установени по интрона, позволяващи приближаването на U1 и U2 snrnps субединиците на сплайцозомата и следователно на 3 SS и 5 SS места, което поражда функционален комплекс (De Conti, Baralle и Buratti, 2013). 16.

Въведение Фигура I-9. Схематично представяне на пътищата на апоптоза. Външният път се активира от извънклетъчни стимули и се задейства от свързването на лиганд (FasL/TNF/TRAIL) с неговия извънклетъчен мембранен рецептор (Fas/TNFR/TRAIL) и активиране на каспази. Вътрешният път се активира от вътреклетъчни сигнали, които реорганизират митохондриалната мембрана, позволявайки излизането на цитохром с към цитоплазмата, активираща каспазния път. Тези каспази могат да бъдат инхибирани от IAF молекулите, които от своя страна се регулират от фактори като Smac/DIABLO, когато излизат от митохондриите в цитоплазмата. И двата пътя са свързани чрез протеолитичното разцепване на Bid. 7. АПОПТОЗА И СПЛИЦИРАНЕ Много от протеините, участващи в процеса на апоптоза, се регулират чрез алтернативно сплайсинг, генерирайки изоформи, които имат противоположни функции, както се случва с гена Bcl-x и Fas. За интереса на тази докторска дисертация някои аспекти на регулирането на алтернативното сплайсинг на Fas ще бъдат описани по-долу. 48

Цели Целите на тази докторска дисертация са: 1. Биохимична характеристика на PRPF40B a. Проучване на местоположението на PRPF40B b. Общ анализ на структурните елементи, необходими за неговото разпределение и функция. ° С. Идентифициране на важни взаимодействия за функционалността на PRPF40B. 2. Функционална характеристика на PRPF40B a. Определете ролята на PRPF40B в алтернативния процес на снаждане. б. Изследване на участието на PRPF40B в транскрипцията c. Общо изследване на функцията на PRPF40B в човешкия транскриптом. 59

Материали и методи

Материали и методи екзони 5 и 7, включително проапоптотични и антиапоптотични изоформи на гена Fas. Амплифицираните PCR продукти се разтварят на 3,5% агарозни гелове. Интензитетите на лентите са количествено определени с програмата Quantity One v4.6.5 (Bio-Rad). Експериментите са проведени в три екземпляра. Количественото определяне на гена Fas чрез PCR в реално време беше проведено с помощта на iq SYBR Green Supermix (Bio-Rad) в ледена термоциклерна станция (Bio-Rad) с олигонуклеотидите FE6/FE7 (Tm 53.5 ° C), които усилват регион между екзони 6 и 7 на гена Fas, включен в про-апоптотичната изоформа. Като вътрешен контрол за всеки експеримент, нивата на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) бяха измерени с помощта на олигонуклеотидите GAPDH-F/GAPDH-R. Експериментите са проведени най-малко пет пъти. Стойностите са представени като (E Fas) CT (Fas)/(E GAPDH) CT (GAPDH), където E представлява ефективността на PCR и CT: CT контролна проба-ct проба. За статистически анализ е използван софтуерът Prism 5.0 (GraphPad). Тестът на t-студент беше приложен за сравняване на средните стойности между пробите. Стойностите на P са представени в графиките със звездички (*, P