Одобрение: 11 октомври 2017 г.
Ключови думи: Стомах, гастроскопия, дихателен тест, язва.
Резюме: Язвеният стомашен синдром на конете (EGUS) е многофакторна единица, която произвежда стомашни лезии на лигавицата. EGUS е бил свързан с рискови фактори, като нас стабилизация, снабдяване със зърно, хипергастринемия поради упражнения, стрес, нестероидни противовъзпалителни лекарства (НСПВС) и дисбиоза (Helicobacter spp.). Целта на това проучване е да се открие Helicobacter spp. върху стомашната лигавица на еднокопитни и за определяне на връзката му с EGUS. Бяха оценени 20 коня с различни породи, и двата пола, конюшни. Извършена е езофагус-гастро-дуоденоскопия и биопсия на лигавицата на жлезата. Пробите бяха подадени на бърз тест за уреаза (URT) и в изследваната популация беше извършен тест за дишане на урея (UBT). Бяха разработени описателна статистика и тест за чувствителност/специфичност. Тестовете за производство на уреаза са по-малко чувствителни по отношение на теста за „златен стандарт“ (урея агар); Не беше възможно да се определи съответствието между тестовете за уреаза и наличието на Helicobacter spp или EGUS. Не беше определено съответствие между тестовете и EGUS или Helicobacter spp., Изисква молекулярна диагностика.
Ключови думи: Стомах, гастроскопия, дихателен тест на урея, язва.
Helicobacter е Грам отрицателна, микроаерофилна, спирална, бичевидна бактерия, първоначално класифицирана в рода Campylobacter, но прекатегоризирана през 1989 г. [14], благодарение на подробното изследване на микроорганизъм, открит в пилорния антрум на хора със стомашно заболяване, наречен оттогава Helicobacter pylori. Въпреки че най-известната му форма е спиралата, тя е плеоморфна. Сферичните форми (кокоиди) се появяват при условия на лишаване от хранителни вещества, излагане на антибиотици или продължително време на инкубация. Предполага се, че тези форми се връщат към бациларното представяне в съответствие със специални условия на околната среда, връщайки своята инфекциозна способност [1, 14].
Най-известният биохимичен профил сред рода Helicobacter е този на H. pylori, чиято най-забележима ензимна активност е способността да хидролизира урея, както и да има алкална фосфатаза, оксидаза и каталазна активност. Въпреки че активността на уреазата се счита за относително често срещана сред хеликобактерните видове, някои от тези бактерии, открити в стомашната лигавица на животните, се различават по своята ензимна активност и въздействие върху тъканите.
Някои микроорганизми, открити в стомашната лигавица на еднокопитни животни (Equus ferus caballus), както здрави, така и улцерирани, са свързани с рода Helicobacter [3, 7, 8, 16], сред тях H. equorum [12]; Въпреки това, участието на Helicobacter в патогенезата на стомашен улцерозен синдром на конете (EGG) все още не е установено, въпреки че съществува презумпцията, че присъствието му в стомашната лигавица на конете е потенциален рисков фактор за въпросния синдром. Поради тази причина настоящото проучване има за цел да открие бактериите чрез тестове за активност на уреазата, в допълнение към установяване на връзката между SUGE и неговото присъствие.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Вид на обучението и етични аспекти
Беше проведено описателно, проспективно проучване с напречно сечение чрез вземане на проби. Изследването е одобрено от Институционалния комитет за грижа и използване на животните от Университета в Антиокия чрез протокол 3082013.
Езофагус - гастро - дуоденоскопия
Проведена е гастродуоденоскопия, след гладуване в продължение на дванадесет и четири часа (h), съответно за твърда и течна храна. Проведена е седация с 10% ксилазин (Anased®, Lloyd Laboratories, Айова, САЩ) (0,5 mg/kg/IV). Впоследствие е извършена ендоскопия с използване на система за видео ендоскоп (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, USA). Макроскопските находки са класифицирани според класификационната скала на степента на стомашни лезии, предложена от MacAllister et al. [единадесет].
По време на обиколката на ендоскопа се накапва вода за подобряване на визуализацията на стомашната лигавица. След като беше извършена гастроскопската оценка и класификация на лезиите, бяха взети три биопсии от стомашната повърхност, лигавицата на жлезата (фундуса) и пилорния антрал, чрез поставяне на гъвкав транс-ендоскопски форцепс (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, САЩ), за извършване на бързи тестове за уреаза (PRU).
Бърз тест за уреаза (PRU)
За провеждане на PRU се приготвя модифициран бульон от карбамид [13], съставен от 500 ml дестилирана вода; 100% урея (Merck, Дарнщат, Германия) 10g; фенолно червено 0,005g; 97% солна киселина 0,2 ml; полученото рН е 7, измерено през индикаторна лента за рН. Бульонът се разпределя в аликвотни части в 0,5 ml обеми и се депозира в 2 ml криовиали, всяка взета биопсия се потапя напълно в бульона и се етикетира. Пробите в бульона се инкубират при стайна температура в продължение на 12 часа за по-късно отчитане.
Реакцията на уреазата се основава на наличието на среда, богата на урея, която също съдържа индикатор за рН (фенолно червено). Когато източникът на ензима уреаза беше потопен (в този случай микроорганизми с уреазна активност), той отговаряше за хидролизата на уреята, присъстваща в средата; Освобождаването на амоний и въглероден диоксид в резултат на реакцията направи средата алкална и предизвика промяна на цвета от жълта (отрицателна) до интензивна червена фуксия, което показва положителна реакция на уреазната активност (ФИГ. 1).
Двадесет проби от жлезиста лигавица бяха взети в два екземпляра, за да бъдат подложени на карбамиден бульон и карбамиден агар ("златен тест"), използвани в лабораторията за ветеринарна микробиология на Факултета по аграрни науки на Университета в Антиокия, за да се потвърди резултатът между двете медии. Карбамидният агар е съставен от основен гел (Urea agar Base Christensen® Merck Millipore, MA, САЩ) 3,6 g, карбамидна сол (Carlo Erba Reagents SAS, Chaussée du Vexin, FR) 7,5 g и 5 капки 97% солна киселина . За да се потвърди ефективността на бульона, се използва инокулум на микроорганизъм с положителна уреазна активност (Proteus spp.).
Тест за дишане (Тест за дишане на урея - UBT)
Базалният дъх на всяко еднокопитно се взима, като се вкарва стъклена тръба (Exetainer® флакон за тестване на дишането 13C, Labco limited, Обединено кралство) в ноздра, докато контралатералната едновременно се запушва, когато еднокопитното изтича, тръбата се затваря незабавно. Впоследствие на всеки индивид бяха дадени 50 mg C13 урея (партида U23001), разредени в 5 ml вода и приложени директно срещу стомашната лигавица през работния канал на ендоскопската сонда. След това, 10 минути след подаване на реагента, се вдишва второ (издишване) в друга стъклена бутилка. Всяка епруветка беше отчетена на масспектрометър с изотопно съотношение (ABCA2 Automated Breath CO2 Analyzer, Sercon® limited, UK). Резултатът, който доказва съотношение на газ, по-голямо от 2Δ (делта), се счита за положителен. Очакваната химическа реакция е представена в следното уравнение: 13 CO (NH2) + H2O → 2 NH 3 + 13 CO2
Статистически анализ (чувствителност и специфичност на диагностичните тестове)
За да се определи способността на диагностичните тестове да откриват истински положителни уреазни реакции, беше направено сравнение на ROC кривите (крива на характеристика на работната характеристика на приемника) между PRU, UBT и карбамиден агар („златен тест“). Този анализ е извършен със софтуера EPIDAT® V 3.1.
РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ
Няма значително разстояние между стандартната линия (диагонал) и оценените криви PRU и UBT (ФИГ. 2), което показва, че резултатите се дължат на случайността, а не на съответствието със златния тест (Ji тест 2 = 0,1728; P стойност = 0,6777). Анализът на ROC кривата показа, че нито PRU, нито UBT са чувствителни за откриване на уреазна активност (ТАБЛИЦА I) в сравнение със златния тест.
SE = стандартна грешка; CI = доверителен интервал; PRU = бърз тест за уреаза; UBT = Тест за дишане на урея
(ТАБЛИЦА II) показва подробно резултатите за всяко от проведените тестове, в съответствие с еднокопитния. Трябва да се отбележи, че бяха избрани фрагменти от жлезистата лигавица, тъй като тя се счита за частта, в която е заразената с Helicobacter spp. Не беше възможно да се установи връзка между PRU и UBT тестовете, нито между всеки от тях и уреазната реакция върху карбамиден агар.
PRU = бърз тест за уреаза; UBT: Тест за дишане на урея; М. Жлезиста = жлезиста лигавица.
Когато беше оценена способността на PRU или UBT да предсказват язва на стомаха, беше очевидно, че при никакви обстоятелства честотата на позитивите не е склонна към тези лица, които са имали язва (всякаква степен).
PRU не е извършен във всички региони на стомаха на всички животни, той се счита главно за тези, които са доказали стомашни лезии степен ≥2 (тежест). Както е видно на фиг. 2 и ТАБЛИЦА I, тестовете за откриване на активност се оказаха не особено чувствителни по отношение на избрания златен тест (карбамиден агар). Някои „слабо положителни“ резултати при PRU също са слабо положителни за UBT, това се обяснява при хеликобактериоза, тъй като H. pylori, като предизвиква тежка лезия, има тенденция да намалява уреазната активност; Това поведение на UBT теста е доказано при хората, че въпреки че са положителни и показват клинична картина, съвместима с хеликобактериоза, те са съмнително положителни за UBT.
Възможно е тестовете за откриване на активността на уреазата да работят по-добре при повърхностни лезии, тъй като на това ниво не е настъпила дисбиоза на коменсалните микроорганизми, за разлика от това, когато има сериозно нараняване, субстратът за микроорганизмите изчезва и те най-накрая намаляват или умират. Съобщава се, че временната инсуфлация на стомаха по време на ендоскопия пречи на UBT, тъй като изкуствената оксигенация засяга активността на уреазата, освен това лошото гладуване причинява смущения между остатъците от храна и активността на уреазата [5].
От друга страна е известно, че има и други микроорганизми, които произвеждат уреаза в стомаха на коне, като Proteus miribialis, Pseudomona aureginosa [2], Klebsiella spp. и Yersinia spp. [7], които могат да объркат резултатите от тестовете за уреазна активност и следователно да ги направят неубедителни за определянето на Helicobacter spp. [7]. Установени са Lactobacillus salivarius и Sarcina ventriculi, както при здрава стомашна лигавица на еднокопитни, така и при язвени лезии; освен това при улцеративна лезия са открити Enterococcus faecium и Escherichia fergusonii повърхностни и интраепителни, съответно [10]. От друга страна, H. equorum, който е специално изолиран от коне, здрави и болни, няма уреазна активност [9], което предполага, че някои от тези микроорганизми могат да участват в патофизиологията на SUGE и да не бъдат открити тестове за уреазна активност.
Друг проблем при тестовете за уреаза е възможната стомашна киселинност, налична при пациенти със СУГЕ, това се обяснява поради кривата на стомашно рН/уреазна активност на Helicobacter; пикът на уреазната активност настъпва при стомашно рН 7,5, няма откриваема активност под рН 4,5 и при рН 4, инактивирането е необратимо [9], което означава, че при тези индивиди, при които се предполага, че същото стомашно рН е било по-малко или по-малко от 4 тестът може да бъде фалшиво отрицателен за Helicobacter spp. В случая на настоящото проучване рН не е измерено в различните части на стомаха, поради което тази информация не може да бъде потвърдена. Идеално е да се провери стомашното рН и да се свърже с появата на язви в различните стомашни региони, в допълнение към съответствието му с уреазната активност [4].
Освен това е установено, че някои епигенетични фактори (никел като апоензим) и генетични фактори като способността на иРНК да транслира в достатъчна степен порядъците на регулаторните гени за производство на уреаза влияят върху чувствителността на тестовете за откриване на уреаза. Интрабактериалната уреазна активност на Helicobacter се регулира най-малко по три начина: първо, бърз отговор чрез активиране на UreI; второ, по-бавен отговор, основан на повишена ензимна активация и трети, хроничен отговор на РНК-пратеник, стимулиращ синтеза на нова уреаза; Всички тези фактори предполагат, че могат да съществуват положителни за уреаза микроорганизми като Helicobacter spp., Включително да участват в SUGE, но те да не могат лесно да бъдат открити чрез тестове за откриване на уреаза.
Би било възможно да се помисли за повторение на тестовете при идентични условия, за да се определи тяхната променливост и възпроизводимост [15], или например за извършване на дублиращи се анализи. Вариабилността на теста също се определя от стадия на инфекция, който пациентът изпитва [15] и от рН на пробата сама по себе си, което може да забави реакцията на фенолно червено; така че някои фалшиви положителни и фалшиви отрицателни резултати могат да бъдат открити по време на разработването на тестовете и комбинацията от клинични признаци и събрани параклинични доказателства са най-доброто поведение за диагностициране на хеликобактериоза при коне. В допълнение, молекулярната диагностика се счита за ключов инструмент при изясняване наличието на Helicobacter spp. в стомашната лигавица на тези еднокопитни.
Трудностите при изолирането на Helicobacter spp. за да потвърди участието си в SUGE, то прави изследването да представи грешка от тип II, тоест да потвърди, че микроорганизмът не е свързан с наличието на стомашни лезии, когато всъщност е свързан; Участието на други положителни за уреаза микроорганизми обаче може да доведе до грешки от тип I, свързващи позитивността с представянето на SUGE, когато неговата причинно-следствена връзка всъщност не е сигурна. Няколко проучвания обаче съобщават за наличие на микроорганизми, съвместими с хеликобактерните видове, както в непокътната, язвена, така и възпалена стомашна лигавица [8], което породи противоречие относно тяхното участие в SUGE. Следователно продължават да се изискват молекулярни изследвания, за да се определи неговата значимост при стомашната патология при еднокопитни, както е ясно при хората.
В този смисъл, проучване, проведено върху животни с обществено снабдяване в Чили, установи 65% положителна реакция на уреаза и наблюдение на извити спираловидно бактерии от хеликобактер в група от язви на стомаха в очното дъно и пилорния антрум [7], показващи по-големи реакции in fundus, което се различава от съобщеното за други видове. За разлика от това, настоящото проучване показва положителна уреазна активност при лезии, по-големи или равни на 2 градуса в 6% от пилорните антрами и 0% в лигавицата на жлезата. Възможно е тази разлика да се дължи на факта, че дискриминацията на порциите не е била разгледана в работата на Cardona et al. [7]. Тези открития насърчават по-специфични проучвания за пълно идентифициране на микроорганизмите, участващи в тези реакции.
Настоящото проучване не установи съответствие между стомашните лезии и активността на уреазата; много е важно да се има предвид, че тези резултати са двусмислени, тъй като използваните тестове (PRU и UBT) не са много чувствителни в сравнение с карбамидния агар (златен стандарт). Следователно не е подходящо да се отнасяме към „бързия тест за уреаза“ като „диагностичен тест“ за Helicobacter spp. Необходимо е да се потвърди целият му биохимичен и молекулярен профил за правилната му идентификация, както и да се определи оптималното време между събирането на пробата и въвеждането в карбамидния бульон. Освен това липсват проучвания за определяне на предпочитани области за растеж на спираловидни бактерии върху стомашната повърхност на коня за неговата изолация, според откритията, открити и докладвани от други автори.
Тестове за откриване на уреазна активност за диагностика на Helicobacter spp. при конете те са двусмислени и лесно се намесват от състояния като лошо гладуване и наличие на коменсални микроорганизми със сходни биохимични профили, те не трябва да се използват за диагностициране на хеликобактериоза, за тази цел е препоръчително да се извърши молекулярна диагностика. Нито трябва да се използва като метод за прогнозиране на язвени лезии в стомашната лигавица на коне.
На лабораторията за ветеринарна микробиология на Университета в Антиокия, на комитета за развитие на научните изследвания (CODI) на Университета в Антиокия за финансовата подкрепа, предоставена за работата, на стратегията за устойчивост за 2013-2014 г. на същия субект и COLCIENCIAS в програмата си за млади изследователи за 2015 г.
[1] БАЙОНА, М.; GUTIÉRREZ, A. Биофилм: механизъм за оцеляване на Helicobacter pylori. Rev. U.D.C.A актуален. & Divulg. Scientif. 16 (2): 335-342. 2013.
[2] БЕЛИ, С .; ФЕРНАНДЕС, У.; SILVA, L. Положителен тест за уреаза при възрастни еднокопитни с язва на стомаха-Helicobacter spp. Архив. Instit.Biolog. 70 (1): 17-20. 2003 г.
[3] БЕЗДЕКОВА, Б .; FUTAS, J. Видове хеликобактер и стомашна язва при коне: клинично проучване. Ветеринар. Med. 54 (12): 577–582. 2009 г.
[4] CAMACHO, P.L .; АНДРЮС, Ф.М. Синдром на стомашна язва на конете. В: Робинсън, NE; Sprayberry, KA. (Ред.). Текущата терапия на Робинсън в медицината на конете. 7-ми изд. Свети Лой: Elsevier. Pp 280-284. 2015 г.
[5] CAMPUZANO, G. Оптимизиран тест за дишане с 13C-урея за диагностика на инфекция с H. pylori. World J. Gastroenterol. 13 (41): 5454-64. 2007 г.
[6] CAMPUZANO, G. Неинвазивна диагноза на Helicobacter pylori: ¿серология, 13 C-уреен дихателен тест или Helicobacter pylori антигени в изпражненията. Med. & Lab. 13 (5-6): 211–231. 2007а.
[7] КАРДОНА, Дж .; СТЕНИ, H .; FERNÁNDEZ, H. Определяне на Helicobacter spp., Стомашни язви при коне. Преподобни MVZ. Кордова. 14 (3): 1831-1839. 2009 г.
[8] КОНТРЕРИ, М.; МОРАЛЕС, А.; GARCÍA, М.; DE VERA, M .; BERMÚDEZ, V .; GUENEAU, P. Откриване на Helicobacter-подобна ДНК в стомашната лигавица на чистокръвни коне. Lett. Прил. Микробиол. 45 (5): 553–7. 2007 г.
[9] HEPBURN, R. Изследване на наличието на хеликобактер в еднокопитния стомах чрез тестване на уреаза и полимеразна верижна реакция и по-нататъшно разследване на прилагането на 13C-уреен кръвен тест върху коня. Лисбург: Вирджински политехнически институт и държавен университет. Теза на степента. 63-71. 2004 г.
[10] НАМЕРЕН, Л.; ДЖЕНСЕН, Т.; OLSEN, S.; MØLBAK, L. Изследване на конни жлезисти лезии на стомаха за бактерии, включително Helicobacter spp. чрез флуоресценция in situ хибридизация. BMC Microbiol. 19: 10-84. 2010 г.
[11] MACALLISTER, C.G .; ЕНДРЮС, Ф.М .; DEEGAN, E.; RUOFF, W .; OLOVSON, S. G. Система за оценка на стомашни язви в коня. Равен Ветеринар. J. 29 (6): 430-3.1997.
[12] MOYAERT, H .; ДЕКОСТЕР, А.; VANDAMME, P.; ДЕБРУЙН, Л.; MAST, J.; BAELE, М.; CEELEN, L.; DUCATELLE, R.; HAESEBROUCK, F. Helicobacter equorumsp. нов., уреасегативен вид Helicobacter, изолиран от конски изпражнения. Internat. J. Система. Еволут. Микробиол. 57 (Pt 2): 213-8. 2007 г.