Субекти

Обобщение

Въведение

Exendin-4 (Ex-4), ново антидиабетно средство, изолирано от слюнчените жлези на чудовището Gila, споделя 53% хомология с човешкия глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1) и е предназначен основно за подобряване на контрола на глюкозата чрез въздействие върху глюкагоноподобния пептид-1 рецептор (GLP-1) (GLP-1R) 16. Изследователите обаче наскоро откриха, че Ex-4 също насърчава разпространението или оцеляването на много клетъчни типове 17, 18 чрез GLP-1R-зависими и независими 19, 20 пътища. Налице е обаче малко информация за ефектите на Ex-4 върху биологичните функции на MSC. В това проучване наблюдавахме благоприятните ефекти на Ex-4 върху разпространението на MSC, миграцията и оцеляването. След това изследвахме дали модулаторната функция на Ex-4 в MSC се дължи на активирането на сигналния път PI3K/Akt.

Материали и методи

Декларация за етика

Настоящото проучване беше проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки и насоките на Комитета по етика на Общата болница на Китайската армия за свобода (Пекин, Китай). Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета по етика на Общата болница на Армията на народната свобода в Пекин (Китай).

Изолиране, култивиране и идентификация на MSC костен мозък.

MSC се изолира от костния мозък и се събира, както е описано по-горе. Накратко, пробите от костен мозък на плъх Sprague-Dawley се разреждат с PBS и се центрофугират при 400 х g за 30 минути. Козината, съдържаща мононуклеарни клетки, се промива два пъти с PBS и се посява в MSC културна среда, състояща се от модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM; Invitrogen Co., USA) с L-глутамин и 10% (v/v) фетален говежди серум (FBS) ). Културите се държат при 37 ° С във влажна атмосфера, съдържаща 5% въглероден диоксид. След 24 часа неприлепналите клетки се изхвърлят и се добавя прясна среда и се заменя на всеки 4 дни. Всяка първична култура се субкултивира в съотношение 1: 2, когато MSC достигне приблизително 80% сливане.

За адипогенна и остеогенна диференциация, StemPro® (Invitrogen Co., USA) са използвани адипогенеза и диференцираща среда за остеогенеза съгласно протокола на производителя. Културите се подновяват на всеки 2 до 3 дни. След 3 до 4 седмици култивиране се оценява адипогенезата чрез инкубиране на клетките с разтвор на Oil Red O за оцветяване на неутралните липиди в цитоплазмата. Alizarin Red S (Sigma-Aldrich, САЩ) е използван за оценка на остеогенната диференциация.

За да се потвърди характеристиката на MSC, клетките, отгледани в пасаж 3, се подлагат на поточна цитометрия, като се използват маркираните с FITC маркери CD29, CD31, CD34, CD45, CD90, CD105 и CD166 (BD Biosciences, САЩ), концентрации, препоръчани от производителя. Клетките, оцветени с белязан с FITC IgG, бяха използвани като отрицателни контроли. Анализът използва FACScan за поне 10 000 събития, използвайки софтуера CellQuest.

Анализ на жизнеспособността на клетките

MSC жизнеспособността на клетките се оценява, като се използва анализ на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT; Sigma-Aldrich, САЩ). Накратко, MSCs бяха засяти в 96-ямкови плаки. След третиране с различни дози Ex-4 (0-20 nm/L, Sigma-Aldrich) в продължение на 12 h, клетките се инкубират с MTT разтвор (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в продължение на 4 h. След това средата се отстранява и към всяка ямка се добавят 100 ul диметилсулфоксид (DMSO). Абсорбцията е измерена при дължина на вълната 570 nm. Данните се изразяват като съотношение между стойността на оптичната плътност (OD) на третираната група и OD на контролната група.

Проточна цитометрия

Експресията на CXCR4, скоростта на апоптоза и разпределението на клетъчния цикъл на MSC бяха оценени чрез поточна цитометрия. След третиране с различни концентрации на Ex-4 (0-20 nm/L) в продължение на 24 часа, MSC се използва при РЗ за откриване на експресията на CXCR4. След измиване с PBS, всяка група клетки се оцветява с FITC-белязан CXCR4 (Bioss, Китай) или с FITC-белязан IgG в продължение на 30 минути при стайна температура.

Броят на апоптотичните клетки се анализира количествено, като се използва анексин V комплект за откриване на апоптоза - FITC/PI (BD Biosciences, САЩ). След третиране, клетките се събират, ресуспендират в 200 ul свързващ буфер и след това се инкубират с 5 ul смес от Анексин V-FITC/свързващ буфер (30 минути, 37 ° С) на тъмно. След това клетките се инкубират с 10 ul пропидиев йодид в продължение на 5 минути и веднага се анализират чрез двувариантна поточна цитометрия, използвайки BD FACSCalibur цитометър.

За анализ на клетъчния цикъл, MSC се третират с Ex-4 (0-20 nm/L) в продължение на 24 часа. След това клетките бяха ресуспендирани в PBS и фиксирани с ледено студен 70% етанол за 24 часа. Фиксираните клетки се изплакват и ресуспендират в 50 ug/ml пропидиев йодид за 30 минути на тъмно. Анализите на поточната цитометрия бяха извършени с помощта на BD FACSCalibur цитометър.

Анализ на клетъчна пролиферация

Клетъчната пролиферация се оценява с анализ на 8 броя клетки (CCK-8) (Институт по биотехнологии Beyotime, Китай) и анализ на пролиферацията на 5-етинил-2'-деоксиуридин (EdU) (RiboBio Co., China). За CCK-8 теста клетките се посяват в 96-ямкови плаки (5 х 10 3 клетки/гнездо) с Ex-4 (0-20 nm/L) в трикратен модел. Тестовете се провеждат 1 до 7 дни след посяването чрез добавяне на 100 ul свежа среда в 10 ul разтвор на CCK-8 за още 2 часа при 37 ° C. OD се измерва при 570 nm. Тестът се повтаря 3 пъти.

Изследването EdU (RIBOBio Co, Гуанджоу, Китай) беше използвано за измерване на способността на клетките да се размножават след третиране с 20 nm Ex-4 в продължение на 24 часа. След инкубация с EdU в продължение на 2 часа, клетките бяха фиксирани с 4% параформалдехид и проникнати с 0,5% Triton X-100. След това, коктейлът Apollo® Reaction (Apollo® 643 Fluorescence and Reaction Buffer) се добавя към средата за още 30 минути на тъмно. След промиване с PBS 3 пъти, клетките се оцветяват с DAPI (Sigma-Aldrich) в продължение на 5 минути и веднага се наблюдават под флуоресцентна микроскопия. Броят на клетките EdU + се изчислява чрез преброяване на поне три произволно разделени полета.

Анализ на западните болтове

Анализи за миграция и заздравяване на рани.

MSC анализът за миграция се извършва с 24-ямкова камера Transwell с размер на порите 8 µm (Corning, USA). Първо, MSC се култивират с Ex-4 (0-20 nm/L) за 24 h; след това в горната камера в среда без серум се посяват 10 5 MSC. Стромен клетъчен фактор 1а (SDF-1, Sigma-Aldrich, 50 ng/ml) се добавя към долната камера. След 12-часова инкубация при 37 ° С, немигриращите клетки в горната камера бяха внимателно отстранени с памучен тампон и клетките, преминали през мембраната, бяха фиксирани в метанол и оцветени с 0 кристално виолетово. 05%. За количествено определяне броят на мигриралите клетки се изчислява чрез преброяване на поне пет отделни случайни полета като съотношение на експерименталните проби към контролните проби x 100.

За анализа на заздравяването на рани, 10 6 клетки бяха засяти в 36 mm плочи и култивирани до 80–90% сливане. Създадена е изкуствена рана с помощта на накрайник за пипета P200, за да се надраска монослоя на сливните клетки. Фотомикрографиите бяха получени незабавно (време 0 h) и след това клетките бяха инкубирани в DMEM, съдържащ 1% фетален говежди серум със или без Ex-4 за 24 h. Мобилизация на клетки и затваряне на рани от драскотини се наблюдава 24 часа по-късно.

Индукция на наранявания от оксидативен стрес и тест TUNEL

Апоптозата на оксидативния стрес при MSC е предизвикана от лишаване от водороден прекис и серум. Накратко, MSC средата беше заменена с DMEM без серум, допълнена с 0.3 mM H2O2, и MSC беше инкубирана при 37 ° С при нормоксични условия в продължение на 12 часа. За експерименти за защита на Ex-4, MSC беше предварително обработен с Ex-4 (0-20 nM) за 12 h; след това средата се изхвърля и се замества с DMEM без серум, допълнен с 0.3 mM H2O2 за още 12 часа. Деоксинуклеотидил трансфераза, медииран dUTP-биотин анализ на крайното ниво на маркиране (TUNEL) се използва за откриване на MSC апоптоза под H 2 O 2, съгласно протокола на производителя. Степента на апоптоза се изчислява като броя на TUNEL положителните клетки на 500 ядра на MSC. Ядрата се оцветяват с хроматиновата боя DAPI. Накратко, клетките бяха фиксирани за 1 час в 4% (w/v) параформалдехид при стайна температура. След специфично маркиране, клетките бяха изложени на DAPI на тъмно в продължение на 5 минути. След това имунооцветените MSC се наблюдават чрез флуоресцентна микроскопия.

Caspase3, ROS, MDA, SOD, GSH и GPX активност.

Тъй като активирането на каспаза3 представлява съществена стъпка в апоптотичния процес, се използва комплект за активност на каспаза3 Ac-DEVD-AMC (Институт по биотехнологии Beyotime, Китай) за откриване на активността на каспаза3 съгласно протокола на производителя. Относителната активност на каспаза3 се изчислява като съотношението на емисията от третирани клетки към необработени клетки. Тестът се повтаря 3 пъти.

Дихидроетидий (DHE; Invitrogen, Германия) се използва за откриване на вътреклетъчна ROS и 10 μM DHE се добавя към клетъчната културна среда, която след това се инкубира на тъмно и се наблюдава при конфокална лазерна микроскопия (Olympus).

Малондиалдехидът (MDA) е краен продукт на липидна пероксидация, която се получава в резултат на окислително увреждане и е надежден маркер за нивото на увреждане на MSC, причинено от H 2 O 2. Глутатионът (GSH), глутатионпероксидазата (GPX) и супероксиддисмутазата (SOD) са важни антиоксиданти, които участват в ефективното елиминиране на свободните радикали и в потискането на действията на оксидативен стрес, които насърчават оцеляването на MSC, изложени на H2O2. Съдържанието на MDA, активността на SOD/GPX и концентрацията на GSH бяха измерени с помощта на търговски комплекти (Институт по биотехнологии Beyotime, Китай), следвайки инструкциите на производителя.

Реактивно лечение

За да се изследва ролята на пътя PI3K/Akt в Ex-4 медиирана пролиферация, миграция и оцеляване на MSC, LY294002 (20 μm/L, клетъчна сигнална технология) се добавя към MSC средата за 4 часа преди третиране с Ex -4 до блокиране на активирането на пътя PI3K/Akt. За експерименти с пролиферация (анализ на клетъчния цикъл и EdU анализ), MSC се третира с Ex-4 в продължение на 24 часа преди горните анализи. За анализа на хемотаксиса, MSC се култивират с Ex-4 в продължение на 24 часа и след това се засяват в камери за хемотаксис в продължение на 12 часа. Освен това, за да се блокира взаимодействието между CXCR4 и SDF-1α, MSC се инкубират със или без CXCR4 антитяло (AMD3100, Abcam, САЩ, 10 μg/ml) в продължение на 2 часа преди лечение с Ex-4 (20 nm/L). В H202-индуцирания модел на апоптоза, MSCs бяха предварително обработени с Ex-4 (0–20 nm/L) за 12 h и след това инкубирани с 0,3 mM H 2 O 2 за 12 h.

Статистически анализ

Резултатите са показани като ± SD на поне 3 повторения. За групови сравнения е извършена еднопосочна ANOVA с пост-хок корекция на Scheffe, използвайки SPSS 17. Стойностите на P

екзендин-4

( ДА СЕ ) Резултатите от поточната цитометрия демонстрират, че MSC са еднакво отрицателни за CD31, CD34 и CD45 и положителни за CD29, CD73, CD90, CD105 и CD166 експресия. ( Б. ) Изолираният MSC показа сходни форми с фибробластите и показа способност за многократна диференциация. Лента, 25 μm.

Изображение в пълен размер

Ефекти от Ex-4 върху жизнеспособността на MSC клетките и пътя PI3K/Akt

Първо, оценихме дали самият Ex-4 има токсични ефекти върху MSC. Както е показано на фиг. 2А, в целия диапазон от използвани концентрации (1–20 nM), Ex-4 има малко влияние върху жизнеспособността на клетките в сравнение с нетретираните клетки, което показва, че Ex-4 няма токсични ефекти върху MSC.

MSC се инкубират с различни дози Ex-4 в продължение на 24 часа. Неговата жизнеспособност беше оценена с MTT и активирането на PI3K/Akt пътя беше оценено чрез Western blotting. ( ДА СЕ ) Ex-4 няма токсични ефекти върху MSC. ( Б. ) Ex-4 активира Akt по зависим от дозата начин. * P # P 21, които медиират класически сигнали за растеж и оцеляване в MSC 22. Следователно, ние изследваме ефектите на Ex-4 върху PI3K/Akt пътя в MSC. Както е показано на фиг. 2В, третирането с Ex-4 повишава нивата на фосфорилиран Akt (p-Akt) по зависим от концентрацията начин. Обаче, в присъствието на PI3K/Akt инхибитори, експресията на p-Akt беше силно инхибирана, което показва, че Ex-4 е активаторът нагоре по веригата на PI3K/Akt в MSC.

PI3K/Akt се изисква за Ex-4 индуцирана пролиферация

За да се установи ролята на Ex-4 в растежа на MSC, променливи дози Ex-4 се добавят към хранителната среда за 24 h и след това разпределението на клетъчния цикъл се анализира чрез поточна цитометрия. Както е показано на фиг. 3А, В, повишена фракция от клетки от групата Ex-4 са във фази S и G 2/M, а по-малко клетки са във фаза G 1 на цикъла, което предполага, че Ex-4 причинява дозозависимо увеличение на броя на делящите се клетки. За да се потвърди допълнително дали промоцията на клетъчния цикъл чрез Ex-4 би увеличила продължителността на живота на клетките, ефектите на Ex-4 върху специфичната за мястото кинетика на растежа на MSC бяха оценени с помощта на CCK-8. Кривите на растеж, показани на фиг. 3С, разкриват, че капацитетът за растеж на MSC постепенно се подобрява с увеличаване на концентрацията на Ex-4. Инхибирането на PI3K/Akt обаче потиска тези ефекти на Ex-4 върху пролиферацията на MSC. Освен това няма съществени разлики между контролната група и 1-nM групата и през първите 24 часа не са открити значителни разлики между групите.

Ex-4 подобрена експресия на CXCR4 и последваща миграция на MSC чрез PI3K/Akt

SDF-1α и неговият уникален рецептор CXCR4 играят ключова роля за мобилизирането и набирането на MSC в увредената сърдечна тъкан след трансплантация. В нашето проучване открихме малка експресия на CXCR4 в нормални MSC, докато Ex-4 повишава нивата на CXCR4 протеин, които достигат своя връх при 20 nM Ex-4 (фиг. 4А). Освен това повишеното регулиране на вътреклетъчните нива на експресия на CXCR4 доведе до увеличаване на експресията на клетъчната повърхност, което се доказва от повече CXCR4-положителни клетки в групата Ex-4, отколкото в контролната група (18,46 ± 1,33% в групата с 20 nM срещу 1,31 ± 0,32% в нормалната група, Р

Дискусия

Доказателства 33, 34, 35 са натрупани за ролята на MSC присадките при лечението на инфаркт на миокарда поради тяхното заместване на миокарда, кардиопротективни и кардиотрофични ефекти 36. Въпреки наблюдаваните благоприятни ефекти от клетъчната терапия, задържането 37, оцеляването 7 и функционалността на присадените клетки 38 все още трябва да се подобрят. Съобщено е, че 99% от трансплантираните клетки се губят след трансплантация 39, 40 поради клетъчна апоптоза, лишаване от хранителни вещества и възпалителна реакция 41. Освен това, липсата на трафик на клетки и/или референтни фактори в трансплантираните клетки допринася за "измиването" на присадените клетки от сърцето и тяхната миграция към отдалечени органи 9. В същото време забелязахме, че броят на MSCs в костния мозък е много нисък и способността им за автоматично обновяване е ограничена, особено в тежката микросреда 5, 42, което представлява критичен проблем: как да се получи достатъчно брой клетки за трансплантация. Следователно ние изследвахме ефектите на Ex-4 върху пролиферацията на MSC, миграцията и индуцираната от H2O2 апоптоза.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Zhou, H. et al. Ефекти на Exendin-4 върху пролиферацията, миграцията и апоптозата на мезенхимни стволови клетки на костния мозък in vitro. Sci. Rep. 5, 12898; doi: 10.1038/srep12898 (2015).

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и разпоредби. Ако откриете нещо злоупотребяващо или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.