UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Факултет по ветеринарна медицина Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis при привидно здрави домицирани кучета и при кърлежи от четири общини в Западна Куба Теза като опция за научна степен на доктор на ветеринарните науки Автор: DMV Maylín González Navarrete, M. Sc Mayabeque, 2018

домицилирани

UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Факултет по ветеринарна медицина Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis при привидно здрави кучета и кърлежи от четири общини в Западна Куба Теза като опция за научна степен на доктор на ветеринарните науки Автор: DMV Maylín González Navarrete, M. Sc Tutors: DMV Adivaldo Henrique Da Fonseca, д-р C. DMV Eugenio Roque López, д-р C. Съветници: DMV María Antonia Abeledo García, д-р C. Lic. Belkis Corona González, д-р C. Mayabeque, 2018

Посвещение На всички нас, които имаме мечтата да запазим да запазим, за да поддържаме целостта на природата и животните като част от нея. На всички нас, които не спираме да мечтаем, да се борим, да разследваме и винаги да търсим най-добрия начин да се запазим. На новите поколения, които сме длъжни да почитаме с работата и напътствията си, като се подготвяме всеки ден по-добре, така че нашият пример да е най-добрият начин за преподаване.

Табличен индекс Таблица 1. Разширение на повърхността, гъстота на населението и плътност на кучетата в извадковите общини. 38 Таблица 2. Количество смеси от кърлежи според етапа от всяка община. 41 Таблица 3. Праймери, използвани за откриване на E. canis чрез вложен PCR. 42 Таблица 4. Графици за амплификация за всеки вложен PCR анализ (Murphy et al., 1998). 43 Таблица 5. Процент кучета с IgG антитела срещу Е. canis според възрастта, породата и пола. 56 Таблица 6. Брой кучета и къщи, взети на проби по общини. Разпределение на включените в извадката къщи според броя на кучетата на къща. 60 Таблица 7. Брой събрани кърлежи и заразени кучета по общини. 65 Таблица 8. Класификация на интензивността на заразяване от R. sanguineus s.l. при кучета с проби. 70 Таблица 9. Степен на заразяване от R. sanguineus s.l. в изследваните общини. 70 Таблица 10. Връзка на променливите и позитивността към E. canis чрез вложен PCR в четири общини от западния регион на Куба (едномерна логистична регресия). 86 Таблица 11. Рискови фактори, свързани с позитивността към E. canis чрез вложен PCR в четири общини в западния регион на Куба. (Многовариантна логистична регресия). 87

100 bp (Promega, Madison, САЩ); Ред 2 и 3: отрицателен контрол; Редове 4-15: ДНК смеси от кърлежи, Линия 16: положителен контрол. 77 Фигура 15. Процент кучета, взети на проби по възрастова категория. 84

Списък на съкращенията, съкращенията и символите ДНК: дезоксирибонуклеинова киселина Ca Cl2: калциев хлорид dntps: дезоксирибонуклеотид трифосфати EDTA: етилендиаминтетраоцетна киселина ELISAi: непряк ензимен имуносорбентен анализ Mg хлорид ml: милилитър mm: милимоларен OR: съотношение на шансовете pb: базови двойки PBST: фосфатно буфериран физиологичен разтвор рН 7,2-7,4 с 5% Tween 20 PBS: фосфатно буфериран физиологичен разтвор PCR: полимеразна верижна реакция ph: Хидрогениален потенциал pmol: пикомол рРНК: рибозомна обороти в минута на рибонуклеинова киселина: обороти в минута TAE: Трис-ацетат-EDTA буфер Taq: ДНК полимеразен ензим, изолиран от бактерията Thermus aquaticus U: единица V: волта µg: микрограм μl: микролитър µm: микромоларна 16S rrna: 16S част от рибозомната РНК: Търговска марка C: Целзий

ОБЩ ИНДЕКС ВЪВЕДЕНИЕ. 2 Хипотеза. 5 Обща цел. 5 Специфични цели. 5 НАУЧНА НОВОСТ И ПРИНОС. 7 ГЛАВА I. БИБЛИОГРАФСКИ ПРЕГЛЕД. 8 1.1. Понятие и история на кучешката моноцитна ерлихиоза. 8 1.2. Етиологичен агент. 9 1.2.1. Таксономия на E. canis. 10 1.2.2. Морфология. 10 1.3. Епидемиология на кучешката ерлихиоза. 11 1.3.1. Географско разпространение на E. canis. 11 1.3.2. Вектори. 12 1.3.3. Домакини. 19 1.3.4. Предаване на E. canis. 1.3.5. Рискови фактори, свързани с инфекция с E. canis. 21 1.4. Патогенеза на кучешката ерлихиоза. 23 1.4.1. Клинична картина. 25 1.5. Диагностика на Е. canis. 27 1.5.1. Диагностика чрез кръвна мазка. 28 1.5.2. Клетъчна култура. 29 1.5.3. Серологична диагноза. 30 1.5.4. Молекулярна диагноза чрез полимеразна верижна реакция в гостоприемника. 31 1.5.5. Молекулярно откриване във вектора. 32 1.5.6. Диференциална диагноза. 33 1.5.7. Множество инфекции или коинфекции. 33 1.6. Профилактика и контрол на кучешката ерлихиоза. 34 1.6.1. Предотвратяване. 34 1.6.2. Контрол на кърлеж R. sanguineus. 35 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛИ И ОБЩИ МЕТОДИ. 38

4.3.5. Идентификация на къщите с кучета, заразени от R. sanguineus s.l. 71 4.2.4. Частични заключения. 73 ГЛАВА V. Ehrlichia canis при кърлежи, събрани от кучета, взети в пробите в изследваните общини. 75 5.1. Въведение. 75 5.2. Материали и методи. 76 5.2.1. Събиране и опазване на кърлежи. 76 5.2.2. Вложен PCR анализ. 76 5.2.3. Последователност и анализ на амплифицираните фрагменти. 76 5.3. Резултати и дискусия. 76 5.4. Частично заключение. ГЛАВА VI. Рискови фактори, свързани с Ehrlichia canis при привидно здрави кучета с местожителство в общините Habana del Este, Boyeros, Cotorro и San José de las Lajas. 81 6.1. Въведение. 81 6.2. Материали и методи. 82 6.2.1. Характеристика на извадковата популация. 82 6.2.2. Епидемиологичен въпросник. 82 6.2.3. Статистически анализ. 83 6.3. Резултати и дискусия. 83 6.3.1. Характеристика на извадковата популация кучета. 83 6.3.2. Анализ на рисковите фактори. 6.4. Частично заключение. 91 ГЛАВА VII. Генерална дискусия. 92 VIII. ОБЩИ ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 98 IX. ПРЕПОРЪКИ. 100 X. БИБЛИОГРАФСКА ЛИТЕРАТУРА. 1 IX. ПРИЛОЖЕНИЯ. 1

Въведение 4. Идентифицирайте рисковите фактори, свързани с инфекция с E. canis при привидно здрави домашни кучета в разследваните общини. 6

Въведение НАУЧНА НОВОСТ И ПРИНОС Присъствието на E. canis се демонстрира за първи път в Куба в кръвни проби на очевидно здрави домицилирани кучета и в техните кърлежи. Ко-инфекцията с E. canis и A. platys се доказва чрез наблюдение на кръвни мазки. Това изследване има важен принос за епидемиологията на кучешката ерлихиоза в Куба, което ще позволи вземането на решения и създаването на бъдещи трансдисциплинарни и многосекторни стратегии за превенция и контрол на болестта 7

Глава I. Библиографски преглед 1.3.2.1. Биологичен цикъл на R. sanguineus Биологичният цикъл на R. sanguineus кърлеж е триоксен (фиг. 1), така че кърлежът се нуждае от трима гостоприемници, за да завърши цикъла си, като гостоприемник за всеки етап и всички линеения се правят в околната среда (ESCCAP, 2016). Фигура 1. Биологичен цикъл на кърлежа R. sanguineus, кърлеж trioxena (Chávez, 2014) Продължителността на биологичния цикъл на кърлежа R. sanguineus зависи от фактори на околната среда като температура и влажност (Estrada-Peña, 2015). Инкубационният период на яйцата и превръщането на ларвите в нимфи ​​и от тях в възрастни е оптимално в диапазона между 25-30 С и относителната влажност в много по-широк диапазон (35-95%), докато те се удължават, ако температурата е нисък. При идеални условия на тропически климат, кърлежите остават активни през цялата година и могат да се наблюдават от три до четири поколения в годината (Dantas-Torres, 2010; León, 2011; Rubio et al., 2015). 14.

ОБЩИ МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Глава II. Общи материали и методи ГЛАВА II. МАТЕРИАЛИ И ОБЩИ МЕТОДИ 2.1. Тип на изследването и извадка от района Описателно изследване на напречното сечение на кучешката ерлихиоза е проведено в три общини на провинция Хавана и една от провинция Маябеке през периода от септември 2013 г. до август 2014 г. (Таблица 1). Таблица 1. Разширение на повърхността, плътност на населението и плътност на кучетата в извадковите общини. Проби от провинция Хавана Mayabeque Вземане на проби Разширение на повърхността (km 2) Плътност на популацията (обитаване/km 2) Приблизителна популация на кучета Habana del Este 141,5 1247,3 17649 Кучета за говеда 134,8 1438,6 19392 Cotorro 65,9 1207,7 7959 San José de las Lajas 593,0 125,2 7424 Критериите за включване на общините имаха лесен достъп и възможност за контакт с животновъди и ветеринарни лекари; също и защото те са периферни общини от провинция Хавана с по-голямо повърхностно разширение и имат градска и селска част. Сан Хосе де лас Лахас е избран за община с най-голяма площ в провинция Маябеке (фиг. 3). 38

Глава II. Общи материали и методи Консенсусните последователности, генерирани с представителни нуклеотидни последователности на 16S rRNA гена на E. canis, достъпни в базата данни GenBank. Пробите са изпратени за секвениране в Центъра за изследване на човешкия геном и стволови клетки, сектор за секвениране на ДНК към университета в Сао Пауло, Бразилия. 2.10. Статистически анализ Данните са таблицирани, обработени и графицирани в програмата Microsoft Office Excel 2016. Направено е сравнение на множество пропорции и за това е използвана програмата CompaProWin_2.0.1 и е използван методът на Wald за сравнение чрез корекция (Castillo и Miranda, 2014). За целите на проучването беше взето под внимание ниво на доверие от 95%. Резултатите бяха представени в таблици и графики, за по-добър анализ и разбиране. 44

Глава III Таблица 6. Брой кучета и къщи, взети на проби по общини. Разпределение на включените в извадката къщи според броя на кучетата на къща. Общини Общо кучета Общо взети проби от къщи Разпределение на взети проби от къщи според броя на кучетата на къща Едно куче Две до три Повече от три кучета Habana del Este 104 73 54 16 3 Boyeros 102 82 67 11 4 Cotorro 82 49 29 12 8 San José de las Lajas 90 46 29 9 8 Общо 378 250 179 48 23 В 56,40% (141/250) от къщите присъствието на положителни кучета за E. canis е диагностицирано чрез вложен PCR тест. По отношение на общия брой къщи на община с положителни кучета, процентите показват още по-тревожна ситуация, като се откроява община Боерос с най-висока стойност (69,51%), значително различаваща се от процентите, установени в общините Которо и Сан Хосе . las Lajas (фиг. 10). 60

Глава III 35/73 (47.94b) 25/46 (54.35ab) 57/82 (69.51a) 24/49 (48.97b) Сан. Хосе де лас Лахас. Которо. Боерос. Източна Хавана. Различните букви се различават значително (P 0,05) Фигура 10. Процент на къщите с положителни кучета E. canis, диагностицирани чрез вложена PCR. Тези резултати показват, че висок процент от хората в четирите разследвани общини живеят с кучета, които са положителни за E. canis, което представлява предупреждение предвид зоонозния потенциал на този патоген (Pérez et al., 2006). Във Венецуела Перес и др. (1996) са получили изолат на E. canis от кръвна култура на асимптоматичен човек. В същата тази страна, десет години по-късно ДНК на тази рикетсия е амплифицирана при шестима души с клинични признаци на моноцитна ерлихиоза (Pérez et al., 2006) и в по-ново време е открит нов генотип на E. canis в кръвни проби, получени от банки кръв в Коста Рика (Bouza-Mora et al. 2017). 61

Глава III 3.3.5. Открити са частични заключения Morulae, съвместими с E. canis и коинфекция с A. platys, което увеличава тежестта на клиничната картина и възможната диагноза на инфекциозния процес. Висок процент от видимо здрави домицилирани кучета, заразени с E. canis, е демонстриран в кръвни проби от тези кучета чрез вложен PCR. Високият процент на къщи на община с положителни за кучета E. canis кучета, живеещи със собствениците им, представлява риск за инфекция от този патоген за хората. 62

ГЛАВА IV видове под името R. sanguineus s.l., чийто брой сестрински видове в целия свят все още не е определен. Тази хипотеза предполага, че таксономичният статус на кубинския R. sanguineus може да изисква ревизия (Gray et al., 2013; Dantas-Torres and Otranto, 2015; Nava et al., 2015) на карибските острови като Гранада, Тринидад, Св. Kitts and Nevis, Martinique, Aruba, Puerto Rico и Haiti отчитат висока честота на поява на този вид кърлежи при кучета (Yabsley et al., 2008; Asgarali et al., 2012; Kelly et al., 2013; Loftis et al . al., 2013; Starkey et al., 2016). A B C D Фигура 11. Морфология на кърлежа R. sanguineus s.l. Мъжки вентрален (A) и гръбен (B) изглед. Женски вентрален (C) и гръбен (D) изглед. 66

ГЛАВА IV 160 140 120 100 80 60 40 20 0 95 84 48 44 48 23 8 158 153 47 16 24 14 16 2 0 0 9 0 Имаго мъжки Имаго женски Нимфи Ларви Общо Habana del Este Boyeros Cotorro Сан Хосе де лас Лахас 73 Фигура 12 Процент на етапите и пола на кърлежите R. sanguineus sl при заразени кучета. Преобладаващите етапи бяха мъжки имаго, последвани от женски имаго, като ларвният етап представлява най-ниската стойност. Подобно поведение се наблюдава в четирите изследвани общини. Резултатите могат да бъдат свързани със скоростта на отделяне на кърлежите от гостоприемника и времето, в което са извършени вземанията на проби, където ларвите от вида R. sanguineus показват модел на проливане предимно през деня. За разлика от тях нимфите и гравираните женски се линят предимно през нощта (Dantas-Torres, 2010). Фактът, че мъжката имаго фаза е тази, която преобладава над останалите стадии, е от значение, тъй като играе важна роля в предаването на Е. canis. Bremer et al. (2005) показа, че мъжките могат да се хранят няколко пъти в отсъствието на женския кърлеж и в този процес могат да придобият и предадат E. canis. 68

ГЛАВА IV Стойностите на разпространението на кърлежите при кучета могат да варират поради гъстотата на кучешката популация, дела на кучетата, лекувани с ектопаразитициди или репеленти срещу кърлежи, както и индивидуалните фактори като порода, възраст и начин на живот на животното. Променливостта в стойностите на степента на заразяване, настъпила в разследваните общини в полза на Боерос, може да бъде свързана с начина на живот, на който те са подложени от собствениците си, където 52% от кучетата са били отпуснати или полуограничен Без контрол или ограничение във времето, това благоприятства контакта с други кучета и излагането на кърлежи (Azevedo et al., 2011; Cardoso et al., 2012). В тази община 66,70% (66/102) от кучетата са били в категорията 2 години и> 10 години, от тях 57,57% (38/66) са били нападнати от кърлежи, докато 35, 29% (36/102) са били в категорията на