Обобщение
Криоелектронните микроскопи, или сканиращи (SEM), или трансмисионни (TEM), се използват широко за характеризиране на биологични проби или други материали с високо съдържание на вода 1. SEM/фокусиран йонен лъч (FIB) се използва за идентифициране на интересни характеристики в проби и извлечете тънко, прозрачно електронно фолио за прехвърляне в крио-ТЕМ.
Резюме
Въведение
FIB се използва широко за приготвяне на проби от ТЕМ за многобройните му предимства 7. Да назовем само няколко: използването на високоенергийни йони с почти нормална честота минимизира ефекта от свързаните с материала диференциални скорости на смилане; регионът, който се взема от общата проба, може да бъде избран с точност по-малка от микрона; премахва се много малко количество материал. Някои неотдавнашни технически постижения направиха възможно използването на FIB и за подготовка на проби от ТЕМ при 2,8-10 криогенни температури. Има няколко предимства пред традиционния метод за приготвяне на криомикротомия 11,12, използван главно за проби от мека материя, като липсата на механична деформация на нарязания лист, липсата на следи от ножове и възможността за приготвяне на композитни проби с твърди/меки интерфейси или компоненти.
Протокол
Забележка: Всички параметри, посочени в този протокол, са валидни за инструментите и моделите, посочени тук. Някои от тези параметри (отбелязани със * в текста) може да са различни, ако използвате друг производител или модел.
1. Прилагане на ПИБ/SEM
2. Замразяване на пробата
3. Фрезоване на йон
4. Крио трансфер към TEM
Представителни резултати
В тази работа са използвани: двулъчева FIB/SEM, оборудвана с наноманипулатор и криогенна камера; TEM с поддръжка на крио-трансфер; крио-прототипна трансферна станция. Антиконтаминаторните (AC) лопатки на крио-препаративната камера и върхът на наноманипулатора (NM) са модифицирани от Gatan. В сравнение със стандартната крио камера, изводите за променлив ток са по-големи, за да осигурят по-голям радиатор за върха на NM. Освен това климатикът е снабден със скоби за свързване на плитките Cu за топлообмен с връх NM. Гумите на FIB/SEM бяха модифицирани, за да позволят на NM да бъде и да бъде вътре, дори когато камерата за проби беше обезвъздушена. Трябва да се отбележи, че параметрите, използвани в тази работа, са най-подходящи за оборудването, споменато по-горе; Тези параметри може да са необходими за регулиране при работа с други видове оборудване. За да се работи с този протокол, трябва да се спазват нормални предпазни мерки при работа с криогенни, азотни и течни вакуумни системи.
Фигура 1. Крио-SEM изображение на спори на A. niger, преди отлагане на Pt.
Фигура 2. Същата област на Фигура 1 след отлагане на Pt, но преди втвърдяване.
Фигура 3. Крио-SEM изображение на същата област на фигура 2, наклонено 52º, след отлагане и втвърдяване на Pt, в процес на фрезоване на изкопа (виж стъпка 3.7).
Фигура 4. Острие, готово за повдигане.
Фигура 5. Студеният връх на наноманипулатора осъществява контакт с фолио.
Фигура 6. Второ криоотлагане на Pt се използва за заваряване на наноманипулатора и фолиото заедно.
Фигура 7. Студеният наноманипулатор се използва за пренасяне на фолиото в зоната на фиксиране на ТЕМ решетката.
Фигура 8. Криоосаждането се използва още веднъж за фиксиране на фолиото към ТЕМ решетката.
Фигура 9. Фолиото се изрязва от наноманипулатора и вече е готово за съхранение на електрони или прозрачност на изтъняване.
Фигура 10. Междинна стъпка на изтъняване, с няколко спори, видими в напречно сечение.
Фигура 11 Крио-SEM изображение на пробата след окончателно изтъняване.; повечето от другите спори са склонни да се смилат, тъй като фолиото е започнало да се навива.
Фигура 12. Съставено изображение на Cryo-TEM на листа. Част от петата е включена в ламелата (черна стрелка).
Дискусия
Поради естеството на криоотлагането (стъпки 3.5, 3.10 и 3.13), голяма част от пробата ще бъде покрита, като по този начин се пречи на изгледа на оригиналната повърхност. Това може да затрудни проследяването на възвръщаемостта на инвестициите, освен ако не се използват множество марки, както е предложено в стъпка 3.3.
По време на стъпки 4.5 и 4.7 рисковете тънки филми да влязат в контакт с въздуха. Това трябва да се избягва, тъй като може да причини влагата във въздуха да образува ледени кристали на повърхността на пробата, евентуално до степен, която да закрива важни характеристики. Тези стъпки трябва да се извършват възможно най-бързо, но в същото време е вероятно да доведат до загуба на пробата от неправилно боравене по време на прехвърляне на сейо. Препоръчително е потребителят да практикува тези стъпки, като използва празни TEM решетки, преди да се направи опит за действителна проба.
В науката за материалите инструментът FIB се превърна във водещия метод за подготовка на проби от ТЕМ за десетилетие от комерсиализацията му. Тъй като може да се използва практически на всеки образец, това елиминира необходимостта от приспособяване на техниката на приготвяне за вида на пробата. Ние сме твърдо убедени, че същото може да се случи и при криогенни температури, благодарение на подробно описаната тук процедура. Прилагането му върху по-големи проби все още зависи от способността за криоконсервиране в стъкловидно състояние, но техники като замразяване чрез потапяне или замразяване под високо налягане от 3,5 може да се окажат оптималното решение на този проблем.
Разкриване
Авторите нямат какво да разкриват.
Благодарности
Това изследване получи подкрепа от проекта QNano http://www.qnano-ri.eu, който се финансира от изследователските инфраструктури на Европейската общност в рамките на Програмата за капацитет на 7РП (грант № INFRA-2010 до 262 163).
Също така благодарим на изследователския съвет Форми на финансова подкрепа.