Понеделник, 3 януари 2011 г.
Методи за класификация на дрождите
ХАРАКТЕРИСТИКИ, ИЗПОЛЗВАНИ ПРИ КЛАСИФИКАЦИЯТА НА Дрождите
- Микроскопски вид на клетките.
- Режим на сексуално възпроизвеждане.
- Физиологични характеристики (особено хранителни).
- Биохимични характеристики.
- Сравнение на геноми чрез повторно асоцииране на ДНК-ДНК или ДНК-РНК
Таксономия: Проучване за класификация и идентификация.
Класификация: Групиране на организмите в таксони (таксони) според сходствата или връзките на техните предци, или и двете.
Идентификация: Сравнение между неизвестен щам и подобен известен.
Номенклатура: Името на приетите таксони.
МИКРОСКОПСКИ АСПЕКТ
Размер на клетката.
Форма: Формата на клетките показва режим на вегетативно размножаване.
Образуване на нишки
Полово размножаване Структура и форма на аскоспорите и телиоспорите
ФИЗИОЛОГИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Способност за ферментация на определени захари (тест за ферментация).
Аеробен растеж с различни съединения (тестове за асимилация), като всеки единствен източник на въглерод или азот.
Ексцизия на арбутин.
ТЕХНОЛОГИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Изследване на ферментационната сила.
Инкубационната температура за тестове на таксономия е 25 ° C, въпреки че оптималната за някои дрожди е по-висока, а за други по-ниска.
МЕТОДИ ЗА КЛАСИФИКАЦИЯ НА ДРЕЖДИТЕ
Метод: Спорообразуването се причинява от култивирането на дрождите в благоприятна среда (предспороносна среда), богата на глюкоза, в която те остават за период от 48 часа при 28 ° С. След това време те се засяват в спороносна среда (спорообразуваща среда), бедна на глюкоза, за да се намали вегетативното възпроизводство възможно най-много и допълнени с вещество, индуциращо спорообразуване като ацетат. В последната среда те ще се съхраняват в продължение на 3 до 5 дни при температура 25 ° C. След този инкубационен период се правят пресни препарати, последвани от микроскопско наблюдение, като се отбелязва наличието или отсъствието на спори, както и техния размер. За да се улесни това наблюдение, в съмнителни случаи може да се направи оцветяване на спори.
В случай на отрицателно спороносене, културите се държат на стайна температура и се изследват ежеседмично в продължение на минимум 4 до 6 седмици.
Състав на медиите:
Преспорулационна среда
Глюкоза 50 g
Екстракт от мая 10 g
Хранителен бульон (Difco) 30 g
Калиев ацетат
Агар 20гр
Вода 1000 мл
Спорифицираща среда:
Глюкоза 1 g
Екстракт от мая 2.5 g
Хранителен бульон (Difco)
Калиев ацетат 9,8 g
Агар 20гр
Вода 1000 мл
Преди тръби средата трябва да се разтопи, тъй като съдържа агар.
Стерилизацията на средата се извършва в автоклав, една атмосфера за 15 минути.
Ферментационната мощност е мярката за процента (V/V) етанол, който щамът на дрождите е способен да произведе.
Този тест първоначално е разработен от Hayduck и описан от Hericstoth и Osztrovsky през 1927 г. Той се основава на определянето чрез загуба на тегло на въглеродния диоксид, който се отделя по време на алкохолна ферментация, съгласно стехиометричното уравнение:
C2H12 06 ——-———— 2 CO2 + 2 CH3-CH2OH
Метод: За да се определи ферментационната сила, 12º гроздова мъст от боме се приготвя от концентрирана мъст, като рН се регулира до 5 с разтвори на натриев хидроксид или солна киселина.
Така приготвената среда се разпределя в 100 ml колби на Erlenmeyer. вместимост, като във всяка се поставят 50 ml среда. Те се стерилизират в автоклав при 121 ° С за 15 минути.
Сеитбата се извършва с платинена дръжка от млади култури, след като мъстта се засее, колбите се затварят с гумени запушалки, снабдени с клапани на Мюлер с концентрирана сярна киселина. Тези клапани позволяват излизането на въглеродния диоксид и предотвратяват навлизането на въздух.
След сеитбата колбите се претеглят и се инкубират при 25 ° С. до постоянно тегло.
Получената разлика в теглото в края на процеса ще показва отделения въглероден диоксид, който умножен по установен коефициент директно дава стойността на етанола, образуван като процент (V/V).
Изчисляване на фактора:
При ферментация на 180 g глюкоза те произвеждат 88 g въглероден диоксид и 92 етанол; следователно един грам СО2 съответства на 1,04 г етанол. Тъй като плътността на етанола е 0,79, 1,04 g съответства на обем 1,3 ce Следователно 1 g CO2 съответства на 1,3 ce етанол.
Разликата в теглото в грамове, умножена по 1,3, дава обема на произведения етанол.
Обем на брада ———————— 1,3 х загуба на тегло = g етанол
100 ———————————————— PF
Обемът на мъстта е 50 ml. скоро:
PF = 100 х 1,3 х загуба на тегло в грамове: 50
P.F. = 2,6 х загуба на тегло в грамове.
На практика се умножава по 2,5, тъй като добивът не е 100.
Резултатът от този тест предоставя важна информация за идентичността на щама, който се изследва.
Таксономистите не разглеждат този тест, но в Института по индустриални ферментации се забелязва, че този тест бързо определя рода и в него, в някои случаи от рода Saccharomyces позволява да се прави разлика между различните видове. Невключването на този тест може да се дължи на факта, че гроздовата мъст не е основно източникът на изследване на дрожди, както се е случило в този институт почти от неговия произход.
ФОРМИРАНЕ НА ПСЕВДОМИЦЕЛИАРНИ КЛОНОВЕ
Метод: Абсорбираща хартия се поставя в чаша на Петри, а отгоре се поставя огъната стъклена пръчка, върху която се поставя пързалка. Комплектът се стерилизира във фурна при температура 120 ° С за 3 часа. Веднъж стерилни и работещи при асептични условия, няколко капки стерилен разтопен малцов агар се нанасят върху предметното стъкло, за да образуват тънък филм. Когато средата е твърда, тя се засява от млада култура (48 часа на малцов агар) с платинена тел, като прави надлъжна ивица и няколко много леки напречни линии. Стерилна вода се излива върху хартията, за да се поддържа висока степен на влажност вътре в плочата.
Възможни разклонения могат да бъдат открити чрез директно наблюдение под микроскоп след инкубация при 25 ° C на 15 и 30 дни след сеитбата. Могат да се видят образувания като хламидоспори, бластоспори и артроспори. Значението на този тест е по-голямо в случай на щамове, които не съдържат спори.
В зависимост от формата и разположението на бластоспорите могат да се разграничат няколко вида псевдомицелий:
- Тип Mycandid. С кръгли или удължени бластоспори и повече или по-малко разклонени.
- Тип микоторула. С кръгли бластоспори и с аксиално разположение в вихрите, наподобяващи купчини кръгли клетки.
- Тип бластодендриум. С удължени и разклонени бластоспори в вихрите.
ФОРМИРАНЕ НА ВОА
Свойството да образува воал върху течна среда се появява при многобройни видове дрожди.
Въпреки че изглежда, че забулването е тясно свързано с нуждите на дрождите от кислород, ферментативните дрожди могат да се забулят точно като неферментативните дрожди. Въпреки това, фактори като състав на средата, форми на контейнера, възраст, количество инокулум са важни за неговото формиране.
Таксономичната стойност на този тест не е важна, но представлява още една информация при характеризирането на вида.
Метод: За изследване на образуването на воал, маята се засява в гроздова мъст от 8 ° Baume.
8 ° гроздова мъст Baumé се приготвя чрез разреждане на качествена концентрирана гроздова мъст в дестилирана вода или получена от прясно грозде. загрейте до кипене и филтрирайте горещо със сироп филтър, след това регулирайте рН на 5. Оставете да се охлади и филтрирайте през сироп филтър.
Във всяка от епруветките с размери 16 х 160 mm се дозират 10 ml.
Отново се стерилизира в автоклава при половин атмосфера в продължение на 30 минути. По този начин имаме бистра и стерилна мъст, подготвена за сеитба.
Споменатата сеитба се извършва чрез преминаване на цикъл от всяка млада култура от 48 часа към тръба с гроздова мъст, като се извършва тази операция в два екземпляра.
Инокулираната среда се съхранява един месец при температура 21 ° C ± 1.
Първото наблюдение се извършва два дни след сеитбата.
Резултатите се записват, както следва:
Наличие на воал със знак V.
Наличие на островчета със знака I.
Наличие на пръстен със знака А.
Отсъствие на воал със знака VN.
Знакът S е запазен за случаите, в които се вижда утайка от дрожди в мъстта, а знакът Т, за които има силно замъгляване и отделяне на мехурчета.
ФЕРМЕНТАЦИЯ НА ЗАХАРИ
Способността на дрождите да ферментират захари се наблюдава чрез култивиране на изследваните щамове в течни разтвори на захарите, които ще бъдат тествани.
Съставът на използваната среда е както следва:
Бакто-дрожди-азотна основа (Difco) 6.7 g
Тест за захар 20 g
Дестилирана вода 1000 мл
Метод: Приготвената среда се разпределя в епруветки със скорост 9 ml на епруветка, снабдена със звънец на Дърам; и се стерилизират в автоклав при 121 ° С (една атмосфера) за 15 минути. Сеитбата се извършва от млади култури (48 часа в агармалта), те се инкубират във фурна при 28 ° С за 15 дни. Тестът се счита за положителен, ако след инкубация в аспиратора се появи газ.
Изследваните захари са: глюкоза, галактоза, малтоза, захароза, лактоза и рафиноза.
Случаят с рафинозата заслужава специално внимание. Средата, съответстваща на щамове, които дават положителни резултати във ферментацията на тази захар, се подлагат на хартиена хроматография, за да се установи кое е съединението, което след разграждането на рафинозата остава свободно в средата.
След хроматографията могат да бъдат три случая:
- Мелибиозата или захарозата са безплатни Ферментация 1/3
- Галактозата остава свободна Ферментация 2/3
- Не се появяват следи от захар Ферментация 3/3
АСИМИЛАЦИЯ НА ЗАХАРИ
Усвояването на захарите се състои в определяне на захарите, които изследваните щамове на дрождите могат да метаболизират окислително. Тъй като цялата ферментирала захар също се усвоява, този тест се провежда само с тези захари, до които щамът не е ферментирал.
Съставът на използваната среда е както следва:
Бакто-дрожди-азотна основа (Difco) 6.7 g
Тест за захар 1 g
Агар 20гр
Дестилирана вода 1000 мл
Сеитбата се извършва от млада култура (48 часа в малцов агар), суспендирана във физиологичен серум. Съдържанието на тази суспензия се излива върху епруветките с наклонените средства на изследваните захари по такъв начин, че цялата повърхност на средата да се импрегнира с инокулат и след това излишната суспензия се изхвърля. Тръбите, засяти по този начин, се инкубират при 28 ° С в продължение на 15 дни, след което съществуването на растеж на повърхността на средата показва положителен отговор, докато липсата му се счита за отрицателна.
Друг начин за извършване на този тест е използването на ауксонографски метод. Този метод се извършва на плочи и всеки от тях може да бъде тестван за няколко захари едновременно.
Използваната среда е:
Бакто-дрожди-азотна основа (Difco) 6.7 g
Агар 20гр
Дестилирана вода 1000 мл
Стерилизира се в автоклав при 121 ° С за 15 минути, след това се оставя да се охлади до 45 ° С и се разпределя върху плочите, в които предварително се поставя суспензия от изследваните щамове във физиологичен разтвор, разбърква се за хомогенизиране и оставя се да се втвърди. Абсорбиращи хартиени дискове, импрегнирани в стерилни разтвори на захарите, които се изследват при 2% в дестилирана вода, се поставят върху инокулираната среда. Плаките се инкубират при 28 ° С в продължение на 3-4 дни, след което се наблюдава дали са настъпили ореоли на растежа, като в този случай тестът се счита за положителен.
АСИМИЛАЦИЯ НА НИТРАТИТЕ
Това е тестът за използването на нитрати аеробно като източник на азот от дрожди.
Двете среди, използвани в този тест, имат следния състав:
Средно 1
Дрожди-въглерод-основа (Difco) 11,7 g
Калиев нитрат 0,78 g
Агар 20гр
Дестилирана вода 1000 мл
Средно 2
Дрожди-въглерод-основа (Difco) 11,7 g
Агар 20гр
Дестилирана вода 1000 мл
Метод: Засяването и в двата случая се извършва по индиректен метод, като се започне от млада култура (48 часа в агармалта), суспендирана във физиологичен серум. Съдържанието на тази суспензия се излива върху епруветките с изследваната наклонена среда по такъв начин, че цялата повърхност на средата да се импрегнира с инокулат и след това излишната суспензия се изхвърля. Веднъж засети, епруветките се инкубират в продължение на 15 дни при 28 ° С. След това се сравнява всяка от културите, принадлежащи към един и същ микроорганизъм, като се наблюдава дали наличието на калиев нитрат е улеснило или не растежа на засетия щам. В случай, че растежът е по-голям в средата, съдържаща нитрат, отколкото в липсващата, резултатът се счита за положителен. Когато не се оценява разлика, тя се отбелязва като отрицателна, тъй като влиянието на нитратите се счита за нула.
ИЗКЛЮЧВАНЕ НА АРБУТИНАТА
Разграждането на арбутин е потвърждаващ тест за активността на ß-глюкозидазата в дрождови щамове.
Използваната среда има следния състав:
Арбутин 5 g
Екстракт от мая 1 g
Агар 20гр
Дестилирана вода 1000 мл
Метод: След като средата се разтвори на водна баня, тя се разпределя в епруветки, към които предварително е добавена капка разтворима железна сол (1% железен хлорид в дестилирана вода). Те се стерилизират в автоклав при 121 ° С за 15 минути и след това се накланят, за да се втвърдят.
Сеитбата се извършва чрез стрии от млади култури, инкубирайки във фурна при 28 ° C в продължение на 15 дни. Удобно е да оставите несемена тръба при същите условия, за да действа като контролна.
Тестът се счита за положителен, когато се наблюдава промяна на цвета по отношение на контролната епруветка след растежа на дрождите, тъй като в случаите, в които арбутинът се хидролизира, се получава свободен хинон, който при взаимодействие с разтворимата железна сол, налична в средата дава тъмнокафяв цвят.
Те са молекулярни техники, базирани на анализ на фрагменти от молекули нуклеинова киселина, най-често използваната електрофореза на кариотип, микросателитен анализ, полиморфизъм на дължина на митохондриалната ДНК, надлъжен полиморфизъм на рестрикционни фрагменти на рибозомна РНК, полиморфизъм на произволно амплифицирана ДНК и анализ на ниски РНК с молекулно тегло.
Молекулярните методи за идентифициране на дрожди и микроорганизми като цяло се основават на изследване на ДНК и РНК молекули.