Обобщение

Чревните запушвания са частично или пълно запушване на червата, което може да причини силна коремна болка, гадене, повръщане и предотвратяване преминаването на изпражненията. Тази процедура за създаване на частични чревни обструкции при мишки е надеждна при изучаване на механизмите на патологичния клетъчен растеж и смърт в червата.

Резюме

Въведение

Чревните запушвания са частично или пълно запушване в тънките или дебелите черва, което предотвратява движението на храносмилателната храна, течности и газове през червата1. Поради запушването, запушването предизвиква удебеляване на чревните стени, стесняване на лумена 2. Чревна непроходимост може да възникне в резултат на коремни или тазови операции, които причиняват образуване на тъкани от коремни сраствания или от стомашно-чревни разстройства като възпалителни заболявания на червата (болест на Crohn), дивертикулит, херния, вълна, стриктура, инвагинация, запек, фекална инфанкция, псевдо- обструкция, тумори и рак на 3, 4, 5. Чревните запушвания в тези случаи често водят до хипертрофия на tunica muscularis 6 .

PO на лумена предизвиква разтягане на червата и увеличава дебелината на гладкомускулния слой около запушването в отговор на необходимостта да се следва функционалната перисталтика 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. Животински модели на чревни PO са разработени за изследване на хипертрофия на гладката мускулатура при мишки 7, плъхове 10, морски свинчета 11, кучета 12 и котки 13, които постоянно развиват подобна хипертрофия в чревните мускулни слоеве.

Тук предлагаме миши протокол за чревна PO хирургия, използваща силиконов пръстен. Мишките, получаващи PO хирургия, надеждно хипертрофират tunica muscularis на червата. В рамките на хипертрофичния мускул, SMC, ICC, PDGFRα + и невроналните клетки са драматично преработени.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Следният протокол е одобрен от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) към Университета на Невада Рено (UNR) Ресурси и е в съответствие с цялата етика по отношение на използването на изследователски животни.

  1. Получават се зрели мишки C57BL/6 (на възраст 4-6 седмици) между 20-30 g. колония на лабораторни мишки в централизиран център за животни при ресурси на UNR.

2. операция за частична обструкция

Забележка: Операциите се извършват в стая, посветена на хирургични процедури. Всички хирургически инструменти са автоклавирани преди операцията. Стерилните хирургически рокли и ръкавици трябва да се носят от целия персонал в хирургичната зала по всяко време.

3.0 надлъжно със скалпел с 15 остриета, като се гарантира, че се врязва само кожата и се избягва порезът в мускулно-перитонеалния слой по това време. С помощта на форцепс и хирургически ножици внимателно отделете кожата от мускулно-перитонеалния слой, без да причинявате разрези на мускулно-перитонеалния слой. След като слоевете се отделят достатъчно (приблизително 1 cm x 4 cm), идентифицирайте linea alba в мускулно-перитонеалния слой и изрежете

2 cm по линията alba, за да се разкрие интраперитонеалната кухина с помощта на микро-форцепс и ножици.

  • Внимателно намерете и идентифицирайте слепеца. Бавно и внимателно отстранете цекума от интраперитонеалната кухина с микро-форцепс, извеждайки проксималното дебело черво и илеума с цекума навън върху стерилната завеса. Веднага навлажнете чревната тъкан със стерилна 0,9% напоена с физиологичен разтвор марля и поддържайте откритите тъкани навлажнени през цялото време, докато сте извън коремната кухина.
  • Намерете и идентифицирайте мезентериума между илеума и проксималното дебело черво. Направете разрез (

    3. наблюдение след операцията.

    1. След приключване на операцията преместете животните в инкубатор в стаята за възстановяване, където температурата и влажността се регулират. Наблюдавайте животните следоперативно на всеки 15 минути за първия час, след това на всеки 30 минути за втория час, докато животните са в инкубатора.
    2. Веднага след като предписаното наблюдение приключи, преместете животните в индивидуалната им клетка и ги наблюдавайте ежедневно за клинични индикации за болка 18 и за да се гарантира, че раната заздравява правилно, без да има признаци на усложнения (дехисценция).

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    мишка

    Фигура 1. Хирургично индуцирана частична чревна обструкция при миши модел. PO се индуцира чрез PO хирургия. Едномесечни мишки бяха обезболени, коремът им беше отворен чрез разрез, около илеума беше поставен силиконов пръстен и отворът беше затворен с шев. Мишките, претърпели операция, успяха да се възстановят за 8 или 13 дни. Съпоставените по възраст и пол мишки функционират по същия начин като PO мишките, освен че няма поставяне на пръстен. (ДА СЕ) Сурови изображения на стомашно-чревния тракт при мишки, претърпели PO или SO операция. Образни мишки на 8 и 13 дни след операцията (Б) Дисектираният GIT от мишки на А. тънките черва нагоре от пръстена беше разтегнат на 8 и 13 дни след PO операция и фекалните пелети в дебелото черво също бяха по-ниски при две 8 и 13 дни след PO операция в сравнение с 13-дневната след OS хирургични мишки за частично обструктивния силиконов пръстен. Скалите са 0,5 cm. кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 2. Променен слой на гладката мускулатура в хирургически миши модел. Представително H&E оцветяване на илеални участъци на чревни PO, жълтеникави и неработещи (NO) мишки. Гладките мускули (SM) и лигавичните слоеве (Mu) са по-дебели при PO мишки при 8 и 13-дневна операция след PO, отколкото SO и NO мишки. Те са 50 μm скали. кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 3. Динамично ремоделиране на клетки при хипертрофия на гладката мускулатура, предизвикана от частична чревна обструкция. Представителни конфокални лазерни сканиращи изображения на хипертрофични илеални участъци, също от PO и без мишки. Имунохистохимично оцветяване с антителата (червено) към MYH11 (SMC), KIT (ICC), PDGFRA (PDGFRα + клетки) или PGP9.5 (NC; невронални клетки), оцветени с DAPI (синьо). SMC в мускулатурата на лигавицата (MM), кръговия мускул (CM) и надлъжните мускулни слоеве (LM), както и PDGFRα + клетките на дълбокия мускулен сплит (DMP), миентеричния регион (MY) и субсерозалния регион (SS ) растяха в хипертрофичен илеум на 8 и 13 дни след РО бяха дегенерирани хирургия, докато ICC в DMP и моя SS, миентеричен плексус (MP), субмукозен сплит (SP), субсерозален NC (SS) и ентерични двигателни неврони (REM) Те са 50 μm скали. кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 4. Резултати от силиконови пръстени, които са твърде големи, твърде малки или не на място в дебелото черво. (ДА СЕ) Хипертрофията на негладката мускулатура се превръща в илеус, ако пръстенът е твърде голям, за да причини обструкция. Пръстен с малко или никакво запушване на илеума. (Б) Чревна исхемия се развива в илеума, ако пръстенът е твърде малък. Пръстенът прави почти пълна обструкция на илеума, което може да увреди тъканите и да доведе до ранна смърт, преди да се развие хипертрофия. (° С) Хипертрофия на гладката мускулатура, развита в дебелото черво поради неправилно поставен пръстен. Пръстенът в дебелото черво се премества от луменално съдържание (изпражнения), което уврежда васкулатурата на мезентериума и причинява масивен кръвоизлив в дебелото черво. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Ние показахме, че мишките, получаващи последователна и възпроизводима чревна PO хирургия, развиват чревна хипертрофия на гладката мускулатура, която имитира чревна обструкция на човека. Хирургията за запушване на червата е разработена за различни животни, включително 7 мишки, 10 плъхове, 11 морски свинчета, 12 кучета и 13 котки. Моделът на чревната непроходимост при мишки има предимства във времето, цената, размера и фенотипа пред други по-големи животински модели. Развитието на хипертрофия при мишки или плъхове отнема само 10-14 дни 10, в сравнение с 2-4 седмици при морски свинчета, кучета и котки 11, 12, 13. Разходите за закупуване и поддържане на мишки също са огромно финансово предимство в сравнение с други модели. Освен това, мишките са малки и лесни за работа при PO хирургия. Най-важното е, че мишките, получаващи обширна хирургична операция, постепенно развиват хипертрофия на червата, докато по-големите животни развиват по-малко екстензивен растеж.

    Този протокол за PO хирургия се счита за основна хирургия за мишки. Всички хирургически инструменти и консумативи трябва да бъдат стерилизирани преди употреба и операцията трябва да се извършва в чистата среда на специална операционна, за да се сведе до минимум замърсяването, което може да доведе до инфекция и възпаление при мишки. Също така, на мишките след операция ще бъдат дадени лекарства за болка. Избрахме да използваме версия с бавно освобождаване на бупренорфин, която е ефективна до 7-8 часа. Също така, след операцията, мишките имат затруднения с дъвченето и преглъщането на твърда храна. За операция след 5 дни на мишките трябва да се дава мека храна (твърда диета с малко добавена вода за омекотяване на храната) и да се премине към нормална твърда диета след 5 дни.

    Нашата чревна PO хирургия осигурява жив модел на хипертрофия за чревна обструкция, при който SMC, ICC и PDGFRα + клетки са необичайно ремоделирани. Този модел на PO е идеален и за разбиране как ентеричните неврони се модифицират от PO и как се засягат основните двигателни дейности в тънките и дебелите черва на 23. Тези клетки могат да бъдат динамично ремоделирани при патологични условия, както и при култивирани условия 15, 16. Наблюдавахме, че тези клетки в SO мишки се държат малко по-различно от нормалните нефункциониращи мишки (Фигура 2 и фигура 3). Чревната обструкция при повечето хора се причинява от коремни сраствания, развити след операция, което води до хипертрофия на гладките мускули 3, 4, 5, 21. След SO операция, също така установихме, че SMC, ICC и PDGFRα + клетките са леко хипертрофични в червата, в сравнение с NO (фигура 3), което предполага, че самата операция може да предизвика хипертрофия на чревните гладки мускули. Ако случаят е такъв, така че операцията не е пълен отрицателен контрол за PO хирургия. NO, както и SO трябва да се използват като сравнение с PO червата.

    В обобщение, ние открихме ефективен/икономически времеви, надежден и повторяем PO хирургичен протокол при мишки, който генерира здрави чревни обструкции. По време на развитието на обструкцията SMC, ICC, PDGFRα +, както и невроналните клетки се преработват динамично в различни тъканни и локални слоеве. Този жив модел на обструкция предлага нови перспективи за познаването на фенотипните промени, тъй като те се появяват при чревна обструкция на клетъчно ниво.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.