мониторинг

  • Обобщение
  • Главен
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • Участници в проучването
  • Кръвни проби
  • Анализ на плазмените аминокиселини чрез AAA
  • Анализ на аминокиселини на изсушени кръвни петна чрез HPLC с флуорометрично откриване
  • Анализ на аминокиселини на тандемни сухи кръвни петна от MS/MS
  • Диетична оценка
  • статистически анализ
  • РЕЗУЛТАТИ
  • ДИСКУСИЯ

Обобщение

Цел: Мониторингът на фенилаланин в кръвта е от решаващо значение за лечението на фенилкетонурия. Сравнихме три метода за измерване на концентрацията на фенилаланин в кръвта: анализатор на аминокиселини, високоефективна течна хроматография с флуорометрично детектиране и тандемна мас спектрометрия.

Методи: Проучихме 22 пациенти с фенилкетонурия на възраст от 12 до 48 години, които са посещавали нашия метаболитен лагер. Кръвта се събира в хепаринизирани епруветки (за анализ от аминокиселинния анализатор) или филтърна хартия (за анализ чрез високоефективна течна хроматография с флуорометрично откриване и тандемна мас спектрометрия).

Резултати: Плазмените концентрации на фенилаланин в кръвта, измерени от анализатора на аминокиселини, са значително по-високи от тези, получени от пълна кръв върху филтърна хартия чрез високоефективна течна хроматография (разлика: 102 μM; 95% доверителен интервал: 23, 181) и тандемна мас спектрометрия ( разлика: 137 μM; 95% доверителен интервал: 58, 216). Концентрациите на фенилаланин от високоефективна течна хроматография и тандемна масспектрометрия не се различават значително (P = 0,5).

Заключения: Когато наблюдават концентрациите на фенилаланин в кръвта за спазване на диетата, клиницистите трябва да вземат предвид използвания метод; Тестовете за пълнокръвна филтърна хартия са постоянно приблизително с 15% по-ниски от плазмените тестове.

Главен

Фенилкетонурията (PKU) е вродена метаболитна грешка, която е резултат от рецесивна генетична мутация, обикновено в гена, който кодира фенилаланин хидроксилаза, ензим, отговорен за хидроксилирането на аминокиселината фенилаланин (Phe) до тирозин (Tyr), което е важно междинен в производството на невротрансмитери. Ако PKU не се лекува, Phe метаболитите се натрупват и невротрансмитерите намаляват, което води до умствена изостаналост, поведенчески разстройства и гърчове. Тези отрицателни ефекти обаче могат да бъдат успешно предотвратени с диетично лечение, ако се започне през първите дни от живота, поради което сега всички държави включват PKU в своите скринингови панели за новородени.

Въпреки че няма универсални насоки, общоприетият подход за управление на ФКУ е строга диета, която включва количеството непокътнат протеин, необходимо за поддържане на концентрациите на Phe в кръвта в обхвата на лечение и допълване с метаболитна формула без Phe (т.е. медицинска храна) така че концентрациите на Phe в кръвта да не надвишават 360 μM (6 mg/dL; за преобразуване на μM в mg/dL, разделяне на 60) поне до 6 години. 1 По-ниските концентрации на Phe са свързани с нормални когнитивни способности при юноши и възрастни, което показва, че оптимални резултати могат да бъдат получени, когато нивата на Phe се поддържат на 120-360 μM до 12 години и 120-900 μM от този момент нататък. 2 Строгият контрол на концентрацията на Phe в кръвта също е от решаващо значение по време на бременност; дете, родено от майка, чиято ФКУ не е под метаболитен контрол, може да страда от умствена изостаналост, микроцефалия и вродена сърдечна недостатъчност. 3

Стремежът към съобразяване с диетата през целия живот означава критична нужда от прости, бързи и точни методи за проследяване на концентрациите на Phe в кръвта. Един прост скрининг метод за PKU при новородени, Guthrie Bacterial Inhibition Assay, 4 се използва повече от четири десетилетия. Оттогава са разработени няколко нови метода, включително аминокиселинен анализатор (AAA), флуорометрия, 5 високоефективна течна хроматография (HPLC), 6, 7 и тандемна мас спектрометрия (MS/MS). 8, 9 Тези нови техники се оказаха жизненоважни за подобряване на точността и скоростта, с които може да се извърши скрининг на новородено, 10, 11, но малко проучвания са изследвали валидността на тези методи за количествен анализ на концентрациите. Абсолютни нива на Phe в кръвта необходими за наблюдение на пациента.

Пациентите с ПКК се различават по отношение на количеството си активен ензим, вкусовите предпочитания към медицинските храни и желанието да се придържат към предписана диета. Всички тези фактори правят лечението силно индивидуализирано и наблюдението е критично. В отдела по медицинска генетика на университета Емори редовно виждаме пациенти с ПКУ в метаболитни клиники и в годишен летен лагер, където ААА взема и тества кръв. Между тези посещения пациентите извършват домашни убождания, оцветяват кръвта си върху филтърна хартия и изпращат пробата в нашата клиника, където тя се анализира от HPLC или отскоро от MS/MS. Тъй като същият пациент е вероятно да тества кръвта си, използвайки AAA и HPLC или MS/MS, или евентуално и трите метода, използвани в момента в нашите лаборатории, ние се интересувахме от сравнението на концентрациите на Phe в кръвта, получени от тези три метода. Следователно, нашата цел беше да анализираме как трите метода (плазмен AAA и HPLC и филтърна хартия цяла кръвна петна MS/MS) се сравняват за проследяване на концентрациите на Phe в кръвта.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Участници в проучването

Метаболитният лагер за момичета в университета Емори е създаден през 1994 г., за да отговори на нуждите на подрастващите, които трябва да се справят с поддържането на ограничителна диета и желаната концентрация на Phe в кръвта им. 12 Момичета подрастващи бяха нападнати първи, поради потенциално вредните ефекти на лошия метаболитен контрол в тяхното потомство; Най-новите ни лагери бяха разширени, за да включват жени от различни възрасти. Кемперите прекарват една седмица, живеейки в къща в кампуса с изследователи на метаболизма и диетолози, които служат като „лагерни съветници“. Дейностите в лагера включват PKU и диетично обучение, класове за готвене, приготвяне на медицинска храна, нови мостри за добавки и социални излети. Получихме данни за този анализ от участници в едноседмичен лагер през 2004 г .: 25 момичета и жени на възраст от 12 до 48 години.

Кръвни проби

През първата и последната сутрин на лагера участниците посетиха Университетския център за клинични изследвания на Университета Емори (GCRC), където бяха измерени техните височини и тегла. Кръв (2-3 ml) се събира в хепаринизирана епруветка за анализ на ААА и се поставя директно върху филтърна хартия от епруветка за събиране на кръв за HPLC анализ с MS/MS флуорометрична пръчка за откриване. Родители (когато къмпинг е бил на възраст под 18 години) или къмпингуващи са дали информирано съгласие преди лагера и цялото събиране на данни е одобрено от Институционалния съвет за преглед на университета Емори.

Анализ на плазмените аминокиселини чрез AAA

Използвахме AAA Beckman 6300, оборудван с он-лайн колориметричен детектор за анализ на аминокиселини, както е описано по-горе 13 с малки модификации. Плазмените проби бяха депротеинизирани с равен обем 6% сулфосалицилова киселина и 400 μL супернатант бяха смесени с 500 μL литиев буфер В и 100 μL 0,25 mM S-аминоетилцистеин (SAEC) преди анализ. Пробата се инжектира върху високоефективна катионообменна колона на Beckman (10 × 0,4 cm) и свободните аминокиселини се разделят, като се използва комбинация от литиеви буфери A, D, E и F на Beckman Coulter (диапазон от pH 2, 9 до 3.9) с програма с променлива йонна сила и температура. След това аминокиселините се измерват колориметрично при дължини на вълните 570 и 440 nm след дериватизация след колона с нинхидрин. Като калибратор беше използван стандартният микс на Beckman. Софтуерът Beckman System Gold е използван за идентифициране и количествено определяне на аминокиселините, присъстващи в пробата, въз основа на техните съответни времена на задържане и стойности на абсорбция.

Анализ на аминокиселини на изсушени кръвни петна чрез HPLC с флуорометрично откриване

Анализ на аминокиселини на тандемни сухи кръвни петна от MS/MS

Диетична оценка

Кемперите попълваха 3-дневни записи за храна през 3-те дни, непосредствено предхождащи първия ден на лагера, които след това анализирахме с помощта на софтуерната програма Ross AAA (версия 3.1, 1997, Ross Products Division, Columbus, OH).

статистически анализ

SAS (версия 9.1, SAS Institute, Cary, NC) беше използван за всички статистически анализи. Изключихме трима къмпингуващи за непълни данни (те имаха полети рано сутринта и напуснаха кампуса, преди да посетят GCRC за измервания и вземане на кръв), давайки ни окончателен размер на пробата n = 22. За всеки от и за трите метода бяха тествани всички проби в два екземпляра и е използвана средната стойност. За да сравним трите метода, изчислихме разликата в средните най-малки квадрати (PROC MIXED в SAS) и създадохме графика на Bland-Altman за разлика. 15 P 2 (Таблица 1). Седем къмпингуващи бяха класифицирани като наднормено тегло или затлъстяване (ИТМ ≥ 25 kg/m 2). При пристигане в лагера средният прием на енергия и протеини е бил 1674 kcal/ден и 59 g/ден, а приемът на Phe и Tyr е бил съответно 9,9 и 82,4 mg/kg/ден.

Таблица в пълен размер

Най-голямата най-малка квадратична средна разлика при сравняване на трите метода е между AAA и MS/MS, като средните концентрации на AAA Phe са приблизително 137 μM по-високи от MS/MS (Таблица 2). Резултатите от AAA също са значително по-високи от тези, получени от HPLC (102 цМ). Не са открити значителни разлики между средните концентрации на Phe, анализирани с HPLC и MS/MS.

Таблица в пълен размер

В нашите цифри за Bland-Altman ние начертаваме процентната разлика на концентрациите на Phe спрямо средните концентрации на Phe. Концентрациите на Phe, получени от AAA, бяха средно с 12% по-високи от тези, получени от HPLC (фиг. 1); изглежда има по-малка разлика при по-ниски концентрации на Phe. Концентрациите на Phe, получени от AAA, са средно с 19% по-високи от тези, получени от MS/MS (фиг. 2). Въпреки че няма значителни разлики в концентрациите на Phe, получени от HPLC и MS/MS, графиката на разликата разкрива, че средно измерванията са били с около 5% по-високи за HPLC (Фиг. 3). Фигурата предполага, че всяка разлика е малко по-голяма при по-ниски концентрации на Phe.

График на Bland-Altman за процентната разлика в концентрацията на фенилаланин (анализатор на аминокиселини - високоефективна течна хроматография) спрямо средната концентрация на фенилаланин, определена по двата метода. Средната процентна разлика се обозначава с плътната линия, а 95% граници с пунктираните линии.

Изображение в пълен размер

График на Bland-Altman за процентната разлика в концентрацията на фенилаланин (анализатор на аминокиселини - тандемна спектрометрия) спрямо средната концентрация на фенилаланин, определена по двата метода. Средната процентна разлика се обозначава с плътната линия, а 95% граници с пунктираните линии.

Изображение в пълен размер

График на Bland-Altman за процентната разлика в концентрацията на фенилаланин (високоефективна течна хроматография - тандемна масспектрометрия) спрямо средната концентрация на фенилаланин, определена по двата метода. Средната процентна разлика се обозначава с плътна линия, а 95% граници с пунктирани линии.

Изображение в пълен размер

ДИСКУСИЯ

Открихме значителни разлики в концентрациите на Phe в кръвта, измерени чрез AAA, HPLC и MS/MS. Анализът на AAA в плазмата дава най-високи измервания на концентрациите на Phe в кръвта; HPLC и MS/MS, които използваха кръвни проби от филтърна хартия, не се различават статистически една от друга и концентрациите на Phe са постоянно с 12% по-ниски за HPLC и 19% по-ниски за MS/MS в сравнение с AAA. Концентрациите на Phe в кръвта, получени чрез трите метода, се различават достатъчно, за да имат реално клинично въздействие, тъй като различните стойности вероятно ще предизвикат различни корекции в диетата или метаболитните храни от лекар или метаболитен диетолог, особено при по-високи концентрации на Phe.

В този анализ сравняваме три метода с помощта на кръвни проби (плазма или филтърна хартия), подготвени и анализирани, както е направено за проследяване на концентрацията на Phe в нашите лаборатории; Ние не сравнихме анализ на плазма и пълна кръв върху филтърна хартия за същия метод. Освен това нашите кръвни проби от филтърна хартия бяха открити от пробата от венозна кръв, взета от всеки кемпер, а не от пръстов отпечатък; следователно тези проби не са напълно представителни за онези, които биха ни били изпратени за рутинен мониторинг. Избрахме да използваме венозните проби само за да избегнем излишен стрес за нашите кемпери от излишни пръчки, както и да осигурим пълно и последователно насищане на филтърната хартия с кръв.

Нашият анализ беше подсилен от сравнително голяма извадка от момичета и жени с ПКУ, от които бяха събрани кръвни проби на гладно и директно наблюдавани върху филтърна хартия в два момента от флеботоми, обучени в Общия център за клинични изследвания. Нашите резултати подчертават необходимостта онези, които участват в мониторинга на концентрациите на Phe, да са наясно с използваната методология, както и получените резултати. Необходими са повече изследвания за сравняване на количественото определяне на концентрациите на Phe в плазмата спрямо пълната кръв върху филтърна хартия, използвайки тези различни методологии; По-доброто разбиране на разликите в аналитичните методи за мониториране на Phe е от съществено значение за разработването на насоки за лекари и метаболитни диетолози, работещи с пациенти с ПК.