Субекти

Обобщение

Въведение

Материали и методи

Пациенти и серуми

Протеинови екстракции

Общо протеини от 50 mg-s бяха извлечени от чисто настъргани семена от B. distachyon линия Bd21, следвайки протокола на Dupont et al.13. Накратко, SDS-Tris екстракционен буфер (pH 6.8), съдържащ 2% SDS, 10% глицерол, 50 mM DTT и 40 mM Tris-HCl, pH 6.8, беше използван за извличане на общия протеин при стайна температура в продължение на един час с редовно слабо доза. вихър. Екстрактът се центрофугира при 16000 g в продължение на 15 минути. Супернатантата се утаява с четири обема ледено студен ацетон. В процеса на екстракция са използвани пет биологични копия.

2D гел електрофореза и имуноблотинг

След утаяване, гранулата се разтваря с IEF буфер (8М карбамид, 2% CHAPS, 100 тМ DTT, 0.2% СА и 0.1% бромофенолно синьо). Изоелектричното фокусиране се извършва в Immobiline DryStrips pH 7-10 от 7 cm (GE Healthcare), при условия на рехидратация за една нощ с 200 µg протеин в 150 µl IEF буфер. 12% полиакриламидни гелове бяха използвани за разделяне на протеините според тяхното молекулно тегло. 2D GE беше извършен в три технически реплики. Тъй като всички 2D протеинови модели от различните биологични и технически реплики бяха идентични, крайният вграден нано-LC-MS/MS беше извършен от три 2D GE технически реплики и петната бяха обединени.

След като GE 2D протеините бяха прехвърлени в ImmobilonP PVDF мембрана (Millipore, Billerica, USA) и блокирани за 1 час с 5% BSA и 0,05% TWEEN20, последвано от инкубация през нощта при 4 ° C с 1:20 разредени кръвни серуми. Имунореактивни протеини бяха открити с козе анти-човешко IgA пероксидазно конюгирано антитяло (Sigma-Aldrich-A0295) в присъствието на хромогенен пероксидазен субстрат 4-хлоро-1-нафтол. Протеиновите петна с имунен отговор бяха изрязани и изпратени за идентифициране на протеини, използвайки онлайн nano-LC-MS/MS. Оризово глутелиново антитяло заедно с анти-заешки IgA като вторично антитяло се използва в 2D Western blot анализ, за ​​да се потвърди наличието на глобулини за съхранение на семена 14 .

Идентификация на протеини чрез нано-LC-MS/MS онлайн

Анализ на последователността и епитопни прогнози

Резултати

глобулин

( ДА СЕ ) - 2D гел електрофореза на общия протеинов екстракт от инбредната линия Bd21. Протеините се разделят на 3-10 pH IPG ленти, последвани от разделяне на 12% акриламидни гелове. Маркираните протеинови петна представляват имунореактивни протеини и са представени за онлайн nanoLC-MS/MS анализ. Диапазонът на молекулното тегло е маркиран от лявата страна. ( Б. да се F ) - представителни имуноблоти, използващи IgA-реактивни серуми от наивни пациенти с целиакия ( Б. - HLA DQ2, ° С - HLA DQ8, д - HLA DQ8/X), терапия, засегната от илеоколичен пациент с болест на Crohn ( И ), Пациент с целиакия HLA DQ2 с безглутенова диета и здравословен контрол ( G ). З.: Извършен е Western blot анализ на общия протеинов екстракт с използване на оризов глутелин 12 и анти-заешки IgA (Sigma-Aldrich) антитела като вторично антитяло.

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Две 7S глобулини (Uniprot ID I1GPS5 и I1GMC8) бяха предимно идентифицирани от петната. I1GPS5 беше признат за основен хит от 14 протеинови точки. Този протеин показва най-голямо сходство с хомолозите на пшеничния протеин за съхранение Globulin-3 и Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 и I6QQ39). I1GMC8 е идентифициран в две протеинови петна и показва най-голямо сходство на последователността с глобулин 1S-подобен протеин, идентифициран от Triticum urartu (M7ZQM3). Брахиподиевият протеин на I1HNH9 показва най-висока хомология с 11S глобулин (A. sativa Q38780). Протеините I1HMK7 и I1IPF2 бяха идентифицирани като 12S глобулини, с най-силно сходство с 12S протеините за съхранение на семена в A. sativa (P12615 и P14812). Sera реагира по-често на хомолога на пшеничния протеин за съхранение Globulin-3A (69,23% - I1GPS5) и глобулините тип 11S и 12S (76,92% - I1HNH9 и I1HMK7). Подобен хомолог на глутенин с ниско молекулно тегло (69,23% I1HMR6) също е силно реактивен имунитет към серумите на пациенти с целиакия.

За да се тества за наличието на глобулини за съхранение на семена в имунореактивните протеинови петна, беше извършен Western blot анализ с използване на първични антитела, специфични за оризовите глутелини, оризовите хомолози на 11S глобулините за съхранение на семена. Силни глобулинови сигнали бяха открити от протеинови петна ID 1 до 14 и от 22 до 28.

Основните глобулинови попадения (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2 I1HNH9), както и най-често идентифицираният проламинов протеин (I1HRM6) бяха подложени на структурно предвиждане от in silico анализ на последователността. Два характерни съседни домена купин-1 бяха открити в глобулините за съхранение на семена 7S и 11S-12S във всички попадения на брахиподиум глобулин (фиг. 2). В повечето от анализираните глобулинови протеини бяха открити региони с възможен свързващ капацитет към свързани структурирани протеини. Силните свързващи региони бяха разположени на границата на подредените неподредени области в глобулините от 7S тип (I1GPS5 и I1GMC8), докато в 11S и 12S глобулините бяха открити значително по-слаби свързващи региони и няма регион на свързване в анализирания брахиподиев проламин . последователност. (Фигура 2)

Изображение в пълен размер

Идентифицирани са десет дълги аминокиселинни пептиди с по-голяма от 70% хомология на последователността със специфични за клетъчните линейни глутенови епитопи в непосредствена близост до регионите за свързване с протеин I1GPS5 (Таблица 2). Идентифицираните епитопни хомолози представляват пептиди с polyQ участъци и са разположени в две богати на глутамин области на протеина. Освен това, шест остатъчен пептид (QPEQPF) е идентифициран в 11S глобулин за съхранение на семена, I1HNH9. Този пептид е дезамидираната версия на известен имунореактивен AGA-специфичен B-клетъчен QPQQPF епитоп (IEDB Epitope ID 147232), който е дезамидиран по време на процеса на целиакия. Тази несвързана версия представлява една от основните цели за серумни DGP антитела при цьолиакия. Интересното е, че нито един от хомолозите на I1HNH9 Poaceae не съдържа този дезаминиран пептид. Не са открити хомолози на епитопи в протеини, свързани с метаболизма.

Таблица в пълен размер

Изборът на предсказуеми свързващи вещества се извърши, използвайки свързващи вещества, по-големи от 1%, въз основа на консенсусни стойности на процентилен ранг. Прогнозите бяха изчислени за всеки алел поотделно. Прогнозираните епитопи се картографират в протеинови последователности.

Изображение в пълен размер

Моделът на третичната структура на I1GPS5 7S глобулиновия мономер е конструиран, използвайки публично достъпни кристални структури на 7S глобулини, изолирани от растения. Идентифицирани глутеноспецифични В-клетъчни епитопни хомолози, които са приблизително 350 аминокиселини, разделени последователно, са картографирани в непосредствена структурна близост. Един от В-клетъчните епитопни хомолози се намира на външната повърхност на бета цевта, образувана от втория домейн cupin-1. Прогнозираните HLA-DQ-специфични Т-клетъчни епитопи и идентифицираният тип I диабет епитоп са разположени на противоположното място на протеиновата молекула, което също може да бъде изложено на храносмилателни ензими (Фиг. 4А, В, С). В случай на глобулин за съхранение на 11S семена I1HNH9, предсказаният DQ2 епитоп е бил в скрито положение, докато хомологът на В-клетъчния епитоп QPEQPF е на повърхността на протеина (фиг. 4D и E).

Мономерните глобулинови структури са моделирани, като се използват публично достъпни растителни ортолози като структурни шаблони и I-Tasser протеинова структура и сървър за прогнозиране на функциите. Позициите на идентифицираните специфични за глутен В-клетъчни епитопни хомолози и предсказаните HLA DQ2 и DQ8-специфични Т-клетъчни епитопи са картографирани в структурата. ( ДА СЕ - ° С ) I1GPS5; ( д, И ) I1HNH9.

Изображение в пълен размер

Дискусия

Въз основа на предишните ни проучвания, голям брой зърнени протеини могат да съдържат пептиди, богати на пролин и глутамин, което ги прави мишена за клетки, представящи антигени, свързани с цьолиакия и имуноглобулини 10, 15, 24. В пшеницата повечето от тези протеини принадлежат към суперсемейството на проламин и са естествено съединение на пшеничния глутен. Съществуват обаче някои протеини от непроламинов тип, които също съдържат пептиди, идентични или много подобни на специфичните за глутен В и Т клетъчни епитопи 10.15.

Нашето проучване потвърди, че протеините за съхранение на зърнени храни от глобулин са специфично свързани с целиакия, тъй като пациентите, страдащи от други възпалителни и имунни заболявания, като болестта на Crohn, не разпознават тези протеини за съхранение на зърнени храни от тип глобулин. Неблагоприятните резултати от имуноблот анализ със серуми от пациенти с целиакия на безглутенова диета също затвърдиха предположението, че глобулините за съхранение на семена могат да действат като вторични В-клетъчни стимуланти поради тяхната силна хомология на последователността спрямо епитопите, причинени от първичните активатори на глутен. В прогресиращите стадии на заболяването космата атрофия и повишената чревна пропускливост допринасят тези протеини да могат да служат като кръстосани антигени. Чревната лигавица, възстановена от пациенти с целиакия на строга безглутенова диета, предотвратява преминаването на погълнати протеини и вероятно по този начин може да се контролира силната имунологична реактивност.

$ config [ads_text16] не е намерен

Заключения

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Gell, G. et al. Характеризиране на протеини за съхранение на глобулин от зърнени култури с нисък проламин във връзка с цьолиакия. Sci. Rep. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

Бележка на редактора: Springer Nature остава неутрален по отношение на юрисдикционни претенции за публикувани карти и институционални принадлежности.