Mar’a Luisa Mansego, Marian Zulet, Javier Campi - n J, Ferm’n Milagro F, JosЋ Alfredo Mart’nez *

CIBER CB06/03 Физиопатология на затлъстяването и храненето, (CIBEROBN), Здравен институт Карлос III, Мадрид, Испания и Център за изследвания в областта на храненето и Департамент по хранителни науки и физиология а, Университет в Навара. C/Irunlarrea 1, Памплона, Навара 31008, Испания

асоциация

Получено на 8 април 2014 г. An. Real Acad. Ферма. Том 80, Nј 3 (2014), страници 614-623

Използвайки епигенетичен подход, бяха анализирани възможни връзки между базалните нива в метилирането на ДНК и по-добрата реакция на загуба на тегло след хранителна интервенционна програма в затлъстелата популация на Съединените щати. Това изследване е идентифицирало 3 ДНК области (гени RGS6, A2BP1 и RASGRF1), които са диференцирано метилирани между субекти с висок и нисък отговор на загуба на тегло. Освен това тези гени участват в един и същ метаболитен път и преди това са били значително свързани със затлъстяването.

Ключови думи: ДНК метилиране; хранителна намеса; отслабване .

Проучване на епигеномна асоциация при загуба на тегло след хранителна интервенция: Проучване RESMENA

Чрез подход на анепигеномика, възможната връзка между изходните нива в метилирането на ДНК и по-добър отговор на загуба на тегло след мултидисциплинарна интервенционна програма бяха анализирани при затлъстела популация от проучване RESMENA-S. Три ДНК области, които са диференциално метилирани (RGS6, A2BP1 и RASGRF1 гени) показаха диференциални нива на метилиране на изходно ниво между високи и ниски отговори на мултидисциплинарната интервенция за отслабване Освен това тези гени са замесени в същия метаболитен път и преди това са били значително свързани със затлъстяването.

Ключови думи: ДНК метилиране; хранителна намеса; отслабване .

Основните епигенетични процеси, които биха могли да повлияят на развитието на затлъстяването, поради ролята му в регулирането на експресията на гени, свързани с него, са метилирането на ДНК в островите CpG, ковалентни модификации в хистоновите опашки чрез метилиране, ацетилиране или убиквитинация и регулаторните протеини, които поддържат хроматин в активно (триторакс) или безшумно (поликомби) състояние (6). Някои автори също включват микроРНК (miRNAs) като епигенетични регулаторни елементи, било защото те контролират експресията на важни епигенетични регулаторни гени като хистонови ацетилази или ДНК метилтрансферази, както и поради епигенетичния контрол на експресията. N на някои miRNAs (23) .

Някои метаболитни промени, свързани със затлъстяването, като хипергликемия и инсулинова резистентност, както и наличието на обещаващи фактори в диетата, като фолиева киселина или метионин, изглежда имат решаващо влияние върху епигенетичните процеси, които засягат гените, свързани със затлъстяването ( 4). В допълнение, тези епигенетични механизми се влияят от други фактори, често свързани със затлъстяването, включително възпаление, чрез действието на провъзпалителни цитокини като TNFα и IL-6 (27), оксидативен стрес (9) и хипоксични състояния, които се развиват при затлъстяване мастна тъкан (26). Всички тези модификации могат да бъдат повлияни от различни явления в околната среда, включително многобройни диетични фактори, и се предполага, че те могат да бъдат предадени чрез тип трансгенерационно епигенетично наследство (20). В този смисъл, предварително проучване (19) свързва затлъстяването при плъхове, хранени с високомаслена диета по време на зряла възраст, с по-голямо метилиране на лептиновия промотор. По същия начин беше показано, че тази диета е способна да промени метилирането на такива важни гени като синтаза на мастни киселини (FAS) или митохондриален ген NDUFB6 (15) .

Следователно, нашата цел беше да изследваме възможни промени в моделите на метилиране на ДНК сред индивиди, които показаха висок или нисък отговор на цялостна програма за отслабване при пациенти със затлъстяване.

2. материал и методи

Проучване на популацията и експериментален дизайн

Изследването на намаляването на метаболитния синдром в Навара-Испания (RESMENA-S) е мултидисциплинарна стратегия, основана на хронохранене и хранително образование, заедно с диетичен и психологически контрол, състоящ се от рандомизирано проучване с паралелен и перспективен дизайн, при което участваха общо 100 лица. (28). Групата RESMENA-S (n = 50) следва персонализирана диета за отслабване (30% ограничение на енергията), с разпределение на макроелементи (въглехидрати/мазнини/протеини) от 40/30/30, висока честота на прием (7 на ден), нисък гликемичен индекс/натоварване и висок антиоксидантен капацитет и спазване на средиземноморската диета (28). Контролната група (n = 50) е спазвала диета със същото енергийно ограничение и базирана на Американската сърдечна асоциация (AHA). Проучването продължи 8 седмици под диетичен и психологически контрол и в двете групи. По време на допълнителни 16 седмици самоконтрол, доброволците следват същия хранителен режим, но без конкретни консултации.

Изследването на нивата на метилиране е проведено в подпроба от 46 затлъстели индивиди (50% мъже). Тези участници бяха избрани от общата популационна извадка и бяха тези, които имаха по-добър или по-лош отговор на интервенцията за отслабване. Те се считат за „висока реакция“ (загуба на повече от 5% от първоначалното си тегло след 24 седмици интервенция; n = 26) и „ниска реакция“ (тези, които не са постигнали загуба от своите 5% тегло; n = 17 ), съответно.

Всички субекти са дали своето информирано съгласие в писмена форма (http://www.clinicaltrials.gov; NCT01087086), изследването е одобрено от Комитета по етика на Университета в Навара (065/2009) и е съгласувано с Декларацията от Хелзинки n (преработена в Южна Корея през 2008 г.).

Антропометрични и биохимични оценки

Извършени са антропометрични измервания (тегло, височина, обиколка на талията и ханша) с обектите по бельо. Телесното тегло беше измерено с точност 0,1 kg с Tanita SC-330, (Tanita Corp, Япония). Височината се изчислява с височина (модел Seca 713, Postfach, Германия) с точност до 1 mm. Индексът на телесна маса (ИТМ) се изчислява като телесно тегло, разделено на квадратен ръст (kg/m 2). Обиколката на талията и тазобедрената става се измерва след утвърдени протоколи (28). Общата телесна мазнина се измерва чрез биоелектричен импеданс на Tanita SC-330 (TanitaCorp, Япония) и чрез двуенергийна рентгенова абсорбциометрия (DXA) (Prodigy, версия на софтуера 6.0, Madison, WI), както е описано по-горе (28) .

Серумните концентрации на глюкоза, общ холестерол, липопротеин-холестерол с висока плътност (HDL-c) и триглицериди са измерени в автоанализатор Pentra C-200 (HORIBA ABX, Мадрид, Испания) със специфичните набори. Концентрациите на инсулин се определят с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен комплект за анализ (Mercodia, Uppsala, Швеция) върху автоанализатор Triturus (Grifols SA, Барселона, Испания).

ДНК екстракция

В началото на изследването бяха събрани проби от венозна кръв, за да се получи ДНК. Генетичната ДНК беше извлечена с помощта на комплект за пречистване на ДНК. Master Purefor Blood Версия II (Epicenter Biotechnologies, Madison, WI, USA) и се съхранява при -80 ° C до обработката.

Определяне на моделите на метилиране на ДНК

Епигенетичният профил на генетичната ДНК е анализиран при 48 индивида, избрани от проучването RESMENA-S, като се използва анализът на човешкото метилиране 450 BeadChip (Illumina, Сан Диего, Калифорния), съдържащ повече от 485 000 отделни CpG места. Накратко, 500 ng обработена с натриев бисулфит генетична ДНК (EZ DNA Methylation Kit; Epitect, Qiagen) беше усилена, белязана, хибридизирана с метилирани и неметилирани сонди и микрочипове сканирани на платформата HiScanSQ от Illumina, Inc. Анализът и определянето на изображенията на сигнала на сондите се извършва с помощта на софтуера Genome Studio, модул за метилиране (Illumina, Inc).

Данните за метилиране на специфично място на CpG са получени от интензитета на сигнала за метилираната (М) и неметилираната (U) сонда за генетична ДНК в тази позиция. По този начин нивата на метилиране (β) са изчислени като пропорция на метилиране по отношение на общия сигнал [т.е. β = M/(M + U)], където обхватът β колебае от 0 (неметилиран) до 1 (метилиран ).

Анализът на метаболитния път беше извършен с използване на анализ на пътя на изобретателност (IPA; Ingenuity Systems, Inc., Redwood City, CA, USA; http://www.ingenuity.com), включително ръчно точни и проследими данни, изцяло получени от библиографски източници.

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на статистическия пакет SPSS 15.0 (SPSS, Чикаго, IL, САЩ). Тестовете на Колмогоров-Смирнов и Шапиро-Уилкс бяха използвани за определяне на нормалността в променливото разпределение.

Разликите в клиничните и антропометричните параметри след интервенцията между високо и ниско реагиращи на диетата бяха оценени с t-тест на Student или U-тест на Mann Whitney. Графиката на вулканите и разликата между различните сайтове на CpG са оценени чрез еднопосочен ANOVA (отговор на ефекта от диетата, адаптиран към възрастта и ефекта от използването на различни микрочипове) благодарение на програмата Array Studio 5.0 (Om Componentes, Cary, NC, САЩ). Честотата на фалшивото откриване (FDR) е приложена в корекциите за множество сравнения.

3. резултати и дискусия

Този проект се фокусира върху избора на лицата, участвали в проучването RESMENA-S до края му. Общите характеристики на участниците, групирани според отговора им на диетичната интервенция, не се различават значително между субектите от контролната група и RESMENA-S по антропометрични променливи, кръвно налягане и липиден профил (Таблица 1). Хората с висока реакция към диета обаче показват значително намаляване на повечето антропометрични параметри по отношение на първоначалните им стойности на същите.

По отношение на резултатите, получени в микрочипа Human Methylation450 BeadChip, след анализ на контролите за качество на споменатия масив, пробата беше намалена до 46 анализирани субекта. Графиката на вулкана показва разпределението на 485 512 CpG места, анализирани по отношение на отговора на загуба на тегло поради диета (Фигура 1). Изследването с микрочипове показва 90 диференциално метилирани CpG места (P-стойност

маса 1.- Клинични характеристики на 46 пациенти със затлъстяване на изходно ниво и след 24 седмици диетична интервенция в популацията RESMENA-S.