Разпространение на чревна микроспоридиоза при деца с тежко недохранване в болница в град Маракайбо

микроспоридиоза

Разпространение на чревна микроспоридиоза при деца с тежко недохранване в болница в град Маракайбо

Acurero-Yamarte Ellen 1 *, Maldonado Ibáñez Adriana 2, Grimaldos Olmos Riam 2, Rivero-Rodríguez Zulbey 2, Bracho Mora Angela 2, Calchi La Corte Marinella 1, Ávila Larreal Ayarí 3, Arráiz Nailet 4

2 Катедра по професионална практика по паразитология,

3 Катедра по епидемиология и статистика,

4 Катедра по молекулярна биология, Училище по биоанализ, Университет в Зулия

За да се сравни разпространението на чревната микроспоридиоза при деца с тежко недохранване и евтрофични деца от Отделението за възстановяване на храненето на болница Chiquinquirá в Маракайбо, Щулия, е използвана техниката на полимеразна верижна реакция (PCR) за идентифициране на Encephalitozoon intestinalis и Enterocytozoon bieneusi в пробите на изпражненията от 50 деца с тежко недохранване и 50 деца с еутрофия, чиято възраст е била стратифицирана, както следва: по-малки бебета (0-11 месеца), по-големи бебета (12-23 месеца), деца в предучилищна възраст (2-6 години) и ученици ( 7 до 12 години). От изследваните видове микроспоридии, Enterocytozoon bieneusi е открит при 14% от тежко недохранените деца и 8% при деца с еутрофия.Не са получени усилвания за Encephalitozoon intestinalis в изследваните групи; При прилагането на статистическия тест c 2, той не е значим за променливите чревна микроспоридиоза и недохранване. Заключението е, че степента, в която недохранването и микроспоридиозата са свързани е трудно да се изясни, тъй като недохранването е многофакторно състояние и все още не е добре установено кой от тези два фактора е причината и коя е последицата.

Ключови думи: Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, CRP, чревна микроспоридиоза.

За да се сравни разпространението на чревната микроспоридиоза при деца с тежко недохранване и евтрофични деца в Отделението за възстановяване на храненето, болница Chiquinquirá в Маракайбо, Щулия, е извършена техника на верижна реакция върху полимеразата (PCR) за идентифициране на Encephalitozoon intestinalis и Enterocytozoon bieneusi в проби от изпражнения от 50 здрави и 50 тежко недохранени деца, чиято възраст е била стратифицирана, както следва: по-малки бебета (0-11 месеца), по-големи бебета (12-23 месеца), предучилищни (2-6 години) и училищни деца (7 -12 години). От изследваните видове микроспоридии, Enterocytozoon bieneusi е очевиден при 14% от тежко недохранените деца и 8% от еутрофните деца. Не са получени амплификации за Encephalitozoon intestinalis в изследваните групи. При прилагането на статистическия тест с хи-квадрат, резултатът не е значим за променливите чревна микроспоридиоза и недохранване. Заключенията са, че степента, до която се отнасят недохранването и микроспоридиозата, е трудно да се изясни, тъй като недохранването е многофакторно състояние и все още не е добре установено кой от тези два фактора е причината и коя е последицата.

Ключови думи: Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, CRP, чревна микроспоридиоза.

Получено: 11-03-14/Прието: 11-23-14

Микроспоридиозата е нововъзникваща и опортюнистична инфекция, причинена от облигатни вътреклетъчни спорообразуващи микроорганизми, които са били класифицирани таксономично като гъби и са известни като микроспоридии. Инфекциите от тези микроорганизми при хора са били практически неизвестни преди епидемията от ХИВ/СПИН, когато Enterocytozoon bieneusi е идентифициран като основен причинител на диария при пациенти с нисък брой CD4 лимфоцити. Следователно се счита, че имунологичният статус и наличието на други недостатъци изглежда са определящи фактори за риска от развитие на микроспоридиални заболявания, така че въпреки че инфекцията може да се появи и при имунокомпетентни пациенти, микроспоридиозата засяга по-често при имунокомпрометирани лица, особено пациенти със СПИН, възрастни хора, диабетици, след трансплантация и със злокачествени заболявания, деца или лица, които използват контактни лещи (1, 2).

Тъй като микроспоридиите имат малък и компактен геном (3), филогенетичното изследване на групата стана трудно. В повечето класически текстове по медицина и гастроентерология те се изучават като паразити; в момента обаче има достатъчно генетични, структурни и метаболитни доказателства, които да ги поставят в царството на гъбите. Някои автори предполагат, че те споделят общ прародител със зигомицети и може би с Mucorales (4, 5).

Понастоящем те се намират във вида Microsporidia, който включва 150 рода и групи приблизително 1200 вида, като 14 от тях са описани като причиняващи болести при хората (2). Видовете, които засягат хората, са разпределени в 7 рода: Enterocytozoon, Encephalitozoon, Anncaliia (Brachiola), Nosema, Pleistophora, Trachipleistophora и Vittaforma и некласифицирани микроспоридии (наричани заедно Microsporidium) (2, 6).

Стомашно-чревният тракт обаче е засегнат само от Enterocytozoon bieneusi и Encephalitozoon intestinalis, който е известен като чревна микроспоридиоза. Тези два вида са придобили все по-голямо внимание, защото причиняват хронична диария при пациенти със СПИН, като се държат като опортюнистични агенти, които освен че предизвикват чревна инфекция, могат да засегнат и други органи и системи (2). Чревната инфекция, причинена от E. bieneusi, се характеризира с персистираща, хронична и инвалидизираща диария при имунокомпрометиран пациент и с остра и самоограничена диария при имунокомпетентни индивиди, включени в контекста на така наречената диария на пътешественика, E. intestinalis произвежда холангиопатия, холангит, холецистит, безразличен, диария, чревна перфорация, обаче, това е вторият по важност вид при хората, заразяването става при поглъщане, вдишване и директно инокулиране на спори, предаване през вода поради откриването му в тази среда и въпреки че червата основната цел на инфекцията, оттам може да се разпространи чрез заразени макрофаги до други органи като: бъбреци, долни дихателни пътища и жлъчни пътища (2, 7).

Както E.bieneusi, така и E.intestinalis също са свързани с недохранване. Недохранените деца, особено тези в тежките категории на недохранване, страдат от много усложнения, като дихателни, системни инфекции (които могат да се появят без фебрилна реакция), очни лезии, гастроентерит, диария и малабсорбция (8). Недохранването обикновено е заболяване в резултат на множество хранителни дефицити или произтичащо от недостатъчното им използване, което от своя страна причинява различни промени в имунния отговор, включително както специфични, така и неспецифични механизми, което прави недохранения пациент податлив на инфекции бактериални, паразитни, произведени от опортюнистични паразити като кокцидии и от микроспоридия E. bieneusi и E. intestinalis (9).

Въпреки важността на тази тема, в това отношение са проведени малко изследвания: Чревна микроспоридиоза и деца с недохранване, така че резултатите от това изследване биха допринесли за разпространението на знанията за тези микроорганизми при силно недохранени деца и това би довело до по-добър клиничен подход към тези пациенти, както от терапевтична, така и от епидемиологична гледна точка, като по този начин допринася за намаляване на заболеваемостта и смъртността поради чревни инфекции.

Поради гореспоменатото беше счетено за важно да се извърши това проучване, за да се определи разпространението на чревната микроспоридиоза при деца с тежко недохранване, затворено в отделението за възстановяване на храните на болницата Chiquinquirá в Маракайбо, намиращо се в община Маракайбо в Сулия. Държава, извършваща сравнение с евтрофни деца, които са посещавали консултации със здрави деца в същата болница.

Материал и метод

Вид разследване:

Проведено е описателно, проспективно, не-експериментално, напречно сечение (10).

Население и извадка

Проучваната популация е съставена от деца, хоспитализирани в отделението за възстановяване на храненето на болница Chiquinquirá в град Маракайбо, от които са избрани тежко недохранените, както и от тези, които посещават консултацията за здрави деца в същата болница, от която бяха избрани евтрофните. Пробата се изчислява, като се използва формулата Z2PQN/E2 (N-1) + Z2QP, която се използва за крайни популации в качествени изследвания, като се избират индивидите на случаен принцип (11). По този начин тя е съставена от група от 50 деца с тежко недохранване (извадка) и друго от 50 деца с евтрофия, всички принадлежащи към социално-икономически слоеве IV и V съгласно метода Graffar, модифициран за Венецуела (12), прилаган чрез получени данни чрез проучване, приложено към клиничната история на всеки индивид.

Лицата бяха стратифицирани според пола при жени и мъже; според хранителния статус при силно недохранени и еутрофни, според възрастта при малките бебета (0-11 месеца), по-възрастните бебета (12-23 месеца), предучилищните (2-6 години) и учениците (7 до 12 години) (13 ).

Поискано е упълномощаването на представителя на всяко дете да извърши оценката на хранителния статус, също така са дадени инструкциите за получаване на изпражненията и е доставен еднократен контейнер за събиране за всеки индивид. За всяко дете бяха приложени следните:

Хранителна оценка: Хранителната оценка е извършена от медицинския персонал на звеното за възстановяване на храненето и консултацията със здрави деца от болница Chiquinquirá в град Маракайбо. За тази цел са използвани клиничната оценка и антропометричната оценка, базирани на показателите за тегло-възраст, височина-възраст, тегло-височина, обиколка на горната част на ръката и трицепс (14), според Фондацията за центрове за изследване на растежа. И Развитие на венецуелското население (Fundacredesa), интерпретиране на стойностите с помощта на параметъра Z-Score, метод, препоръчан от СЗО за оценка на дела на момчетата и момичетата, които могат да бъдат считани за изложени на риск (15).

Паразитологична оценка: След като фекалните проби бяха издадени, те бяха прехвърлени в лабораторията по паразитология на Школата по биоанализ на Университета в Зулия, където бяха обработени чрез прясно изследване с 0,85% физиологичен физиологичен разтвор, временно луголно оцветяване и техника на концентриране на Ричи върху същия ден от събирането му (16). Част от фекалната проба беше замразена за по-късно PCR анализ.

Анализ на молекулярната биология

Извършени са 100 проби от замразени изпражнения:

Полимеразна верижна реакция (PCR)

1. ДНК екстракция

За да се извлече геномната ДНК на E. bieneusi и E. intestinalis от проби на изпражненията, тя се извършва чрез стандартизирана процедура в лабораторията, която включва някои етапи от протоколи за ензимен лизис, термични и механични удари, описани по-рано. (17) Приблизително 0,5 до 0,7 грама изпражнения се прехвърлят в 2 ml епендорфска епруветка, ресуспендират се в 1 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS: 0,1 М Na2 HPO 4, 0,1 М NaH 2 PO 4, рН 7,5) и се филтрират през стерилна марля. Хомогенатът се центрофугира при 10 000 оборота в минута и получената пелета се промива 3 пъти с 1,5 PBS буфер за отстраняване на разтворими замърсители Получената пелета се промива с 1 ml 0,15 М NaCl три пъти или докато супернатантата се изчисти. Пелетата се ресуспендира в 600 ul лизисен буфер (100 mM Tris-Cl рН 8, 25 mM EDTA, 0.25% SDS) и се подлага на 5 цикъла на замразяване-размразяване, инкубирайки епруветката в сух лед-етанол за 5 минути. И се размразява при 37 ° С в продължение на три минути.

След последното третиране се добавят 10 uL от 20 mg/ml протеиназа К. И се инкубира при 55 ° С за една нощ.

Прибавят се 60 uL CTAB-NaCl (0.7M NaCl, 1% CTAB) и се инкубират при 65 ° С за 1 час. Извършва се екстракция с 500 uL хлороформ, след това фенол-хлороформ и хлороформ. Водната фаза се възстановява в друга епендорфска епруветка и ДНК се утаява с 600 uL изопропанол, инкубирайки я при стайна температура в продължение на 45 минути и след това центрофугиране в продължение на 30 минути при 14 000 rpm. Пелетата се ресуспендира в 50 uL TE буфер. 10,5 µL от пробата се използва за амплификационни анализи.

2. ДНК амплификация

Областите на SSU-rRNA (малка субединица на рибозомната РНК) на микроспоридия се усилват, използвайки праймери, специфични за Encephalitozoon intestinalis, SINTF 5 ? TTTCGAGTGTAAAGGAGTCGA3 ?, чиято позиция в последователността е от 362 до 382 и SINTR 5 ? CCGTCCTTGCTCC, позиции 861 до 881, които усилват 520 bp продукт; и за Enterocytozoon bieneusi, EBIEF1 5 ? GAAACTTGTCC ACTCCTTACG3 ?, чиято позиция в последователността е 295 до 315 и EBIER1 5 ? CCATGCACCACTCCTGCCATT3 ?, позиция 881-901, с усилващ продукт от 607 bp.

По същия начин бяха монтирани съответните отрицателни контроли (10 ml дестилирана вода) и положителни контроли, съгласно изследваните видове микроспоридии (10 ml закалена ДНК на E. intestinalis или E. bieneusi). GoTaq Flexi ДНК полимераза (Promega) се използва за усилване. Праймерите и необходимите PCR условия бяха променени така, че амплификацията да се случи във всеки отделен случай.

Реакциите бяха проведени в термоциклер (PTC-100 Peltier Thermal Cicler), поставени бяха напълно идентифицираните епруветки. PCR циклите се провеждат съгласно протокола, определен за всяка двойка праймери, за които трябва да се извърши предварителна стандартизация. За олигонуклеотидите SINT5/3, специфични за Е. intestinalis, стъпката на денатурация от 5 минути при 94 ° C и 35 амплификационни цикъла се извършва два пъти непрекъснато, след това 30 секунди при 45 ° C (подреждане на олигонуклеотидите) и 30 секунди при 72 ° С (полимеризация). За да завършите усилването, 5 минути при 72 ° C.

От друга страна, за олигонуклеотидите EBIE5/3 от E. bieneusi също бяха проведени 35 цикъла от 5 минути при 94 ° C денатурация, след това 30 секунди при 94 ° C от същия процес, последвани от 30 секунди при 55 ° C (подравняване на олигонуклеотидите) и да завърши 90 секунди при 72 ° C, последният етап, наречен полимеризация.

3. Електрофореза на ДНК продукти

PCR продуктите се разделят на агарозни гелове с хоризонтални камери (BIORAD). Използваната концентрация на агароза е 2%. TBE (89mM Tris-Borate, 2mM EDTA pH8) се използва като работещ буфер. Изпълнението се извършва при 90v/cm в продължение на 40 минути. Геловете се оцветяват като етидиев бромид, визуализират се в ултравиолетов трансиллюминатор и се снимат със системата за фотодокументация DigiDoc UVP. Включен е маркер за молекулно тегло PROMEGA DNA Ladder 1000 bp.

Анализът на данните беше извършен чрез описателна статистика, използвайки абсолютни стойности и проценти, за които бяха изготвени таблици с получените резултати, представляващи основните изследвани променливи. Чи квадратът на Пиърсън (c 2) е използван с ниво на доверие 95% (стр

Използвайки техниката на полимеразна верижна реакция (PCR), при 11 индивида е открита ДНК на микроспоридия, 7 проби са амплифицирани за E. bieneusi от групата на тежко недохранените деца, което представлява разпространение на този микроорганизъм от 14%, докато това за групата на деца с еутрофия, амплифицирани са само 4 проби, като се получава преобладаване от 8%, при прилагане на статистическия тест c 2 не е било значимо за променливите недохранване и чревна микроспоридия (c 2 = 0,9 p E. intestinalis в изследваните групи. Получените резултати според използваната техника може да се види в Таблица 1. Фигури 1 и 2 показват някои от резултатите от хоризонталната електрофореза в агарозни гелове.

Таблица 1. Разпространение на чревна микроспоридия, открита чрез PCR при сериозно недохранени деца от звеното за хранително възстановяване и при деца с еутрофия от консултацията на здрави деца от болница Chiquinquirá в Маракайбо, щат Зулия. Венецуела, 2013.