Размер на текста

Четец на съдържание

5.1 ВИДОВЕ И ИЗБРАНИ

Културните среди се определят главно от техните химични качества, т.е. от техния състав; Те също трябва да бъдат определени от техните физически качества, като състояние, соленост и т.н.

Повечето от използваните средства имат името, дадено от онзи, който ги е формулирал; Други произтичат от модификации на родови носители, които са най-известни. Сред първите можем да споменем:

Изборът на хранителната среда се прави въз основа на предишните налични знания: вид, сорт, вид култура инвитро, условия на инкубация и т.н., и ще бъде до голяма степен отговорен за успеха или провала на процеса. Обикновено се избира най-богатата среда, която позволява видът или сортът, тъй като растежът ще бъде по-добър.

5.2 ВИДОВЕ СЪЕДИНЕНИЯ СРЕДЕН

1. Минерални соли: макронутриенти и микроелементи

3. Регулатори на растежа

4. Източник на въглерод

5. Други органични съединения

6. Други съединения за специфична употреба

7. Желиращ агент (ако е приложимо)

8. Добавки с неопределен състав

Функциите на тези съединения могат да бъдат хранителни за развитието на растенията, но могат да имат и допълнителни функции. Например Zn влияе върху синтеза на ауксини.

Минералните соли и главно макронутриентите, освен че всеки има специфична роля в храненето на експланта, са отговорни за крайната соленост на средата, която ще определи по-големия или по-малкия капацитет на усвояване на хранителните вещества в зависимост от вида. от видове, които се култивират.

Културите извършват известна фотосинтеза, но храненето им е предимно хетеротрофно; Те се нуждаят от минерални съединения, а също и от източника на въглерод.

Хормоните, които трябва да бъдат осигурени, обикновено са ауксини и цитокинини, но тъй като времето за култивиране се удължава инвитро и чрез извършване на субкултури, експлантатът постепенно придобива способността да синтезира собствените си ауксини или цитокинини, преставайки да изисква техния екзогенен принос към средата. Това явление е известно като привикване.

5.3. СЪСТАВ НА РАСТИТЕЛНИ МЕДИИ

• Ауксини: Индол-оцетна киселина (IAA), нафтален-оцетна киселина (NAA), индол-маслена киселина (IBA), 2,4-дихлоро-фенокси-оцетна киселина (2,4-D)

• Цитокинини: бензиладенин (BA), кинетин (KIN)

• Гиберелини: Гиберелова киселина (GA3)

• Абсцизова киселина (ABA)

• Други регулатори на развитието на растенията

Сред тях добавянето на ауксини и цитокинини е често, в различни пропорции, в зависимост главно от вида на диференциацията, която трябва да се предизвика и вида на видовете, които се култивират. Използването на други регулатори е много по-случайно.

Въглехидрати:

• Монозахариди: глюкоза, фруктоза, галактоза, маноза, арабиноза, рибоза, ксилоза

• Дизахариди: захароза, малтоза, целобиоза, трехалоза, лактоза

• Тризахариди: рафиноза

• Полизахариди: нишесте, целулоза Сред тях често използваната в културната среда е захарозата.

Други органични съединения:

• Аминокиселини

• Полиамини Употребата му е разнообразна: за осигуряване на допълнителен източник на азот в аминна форма, за получаване на морфогенни процеси и др. Добавки с неопределен състав:

• Извадки мая, малц, месо, зеленчуци (картофи, царевица, корени и коренища)

• Плодови или зеленчукови сокове (портокал, банан, ананас, домат, картофи, кокосово мляко)

• Хидролизиран казеин Употребата му е нежелателна, тъй като не може да се даде точен състав на добавения екстракт, те могат да бъдат полезни само в конкретни случаи.

Специфични съединения:

• Антиоксиданти: лимонена киселина, аскорбинова киселина

• Адсорбенти: активен въглен

• Контролери за осмотичен потенциал: полиетилен гликол, манитол Приносът му към средата може да бъде определен при специфични условия.

5.4. ЕФЕКТИ ОТ ВАРИАЦИИТЕ В ВИДОВЕ И КОНЦЕНТРАЦИИ

Приносът на всички съединения към хранителната среда трябва да се извършва в повече или по-малко широки граници в зависимост от конкретното съединение и in vitro културата, която ще се извършва (видове и др.) Както неговият дефицит, така и излишъкът му причиняват негативни ефекти върху растежа и развитието на растението.

За да илюстрираме този аспект, можем да разгледаме ефекта на концентрацията на азот върху две сортове хризантема: и за двете има оптимален диапазон, въпреки че при единия азотните вариации влияят много повече на растежа, отколкото при другия. В идеалния случай за всяко съединение трябва да се установи подходящ диапазон за значителна група in vitro култури.

ауксини цитокинини

Брой стъбла адвентиони, образувани директно в експланти от хризантема, отглеждани в среда на МС с нарастващи концентрации на азот. (Рост и Бокелман, 1975)

По отношение на източника на въглерод, който трябва да се достави, най-често използваната е захарозата, която е обикновената захар и тази, която често се използва от растенията. Концентрацията му в хранителната среда е от 2 до 3% и само някои специализирани видове култури могат да изискват по-големи количества. Концентрацията му също има ефекти, подобни на тези, наблюдавани при азота.

Ефект от увеличаване на концентрациите на захароза върху директното образуване на адвентивни стъбла при
от цветни дръжки на две сортове хризантема. (Roest и Bokelmann, 1975)

Диапазонът на принос на растителните хомони е по-сложен за определяне, тъй като те действат при много ниски концентрации от микромоларен ред и ефектът, който имат, не се произвежда само от всеки специфичен хормон, но в повечето случаи те се дължат на относително количество на някои хормони спрямо друг или други. Освен това неговите ефекти имат силна зависимост от вида на култивираното растение, вида развитие, което трябва да се постигне, характеристиките на експлантата и системата на култивиране. Хормоните, които обикновено се доставят в хранителната среда, са ауксини и цитокинини. Техните ефекти върху развитието върху относителния мащаб на ауксини спрямо цитокинини могат да се видят на фигурата по-долу. От друга страна, връзките между двата вида хормони не са линейни. Появата на тази цифра ще варира, ако предоставените 2 специфични хормона са друг ауксин и друг цитокинин.

Относителни концентрации на ауксини и цитокинини, необходими за растежа и морфогенезата.

Процент люцерна кали, които произвеждат адвентивни стъбла, когато се инкубират в среда с различни концентрации на ауксини и цитокунинини. (Saunders and Bigham, 1975)

5.5 ФИЗИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА РАЗРАСТВАЩИТЕ МЕДИИ

Културните среди, както са формулирани, ще бъдат течни и за да бъдат аерирани е необходимо използването на контейнери с висока повърхност, които се разбъркват хоризонтално със скорост 100-200 rpm. Хранителните вещества са хомогенно разпределени в средата и лесно се усвояват, което позволява бърз растеж. Отглеждането в течна среда обаче създава проблеми за различни видове, предимно дървесни.

Някои алтернативи на необходимостта от разклащане на течни културни среди са културата на "хартиен мост" и "плаващи мембрани", въпреки че нито една от тях не е лесно използваема. Друг вариант е този на двуфазна среда, в която към култура в твърда среда се добавя тънък слой течна среда; новите съединения на течната среда се дифузират в твърдата среда, откъдето експлантатът ще ги отведе, модифицирайки техния модел на развитие, ако те са различни от тези на първоначалната твърда среда; по този начин се избягва прехвърлянето на експлантата на културна среда, за да се модифицира нейният модел на развитие. В тази система дифузията на съединенията между двете фази не се контролира.

Друга алтернатива на течните среди са така наречените твърди или полутвърди среди, в които се добавя нехранително съединение, което желира средата.

Желиращият агент обикновено е твърдо вещество, което при добавяне към културална среда се разтваря чрез силно нагряване (близо до 100 ° C) и кара средата да придобие консистенция на гел, когато се охлажда до по-ниски температури. Един от най-добрите желиращи агенти, налични за in vitro култура на растителна тъкан, е агар, известен също като агар-агар. Желиращите агенти трябва да отговарят на редица изисквания: да не се усвояват от експлантата, което би накарало средата да се върне в течен стадий, когато се консумира, да не пречи на усвояването на хранителните вещества от хранителната среда и да остане стабилно с течение на времето.

Агарът е естествен, неразклонен полизахарид с високо молекулно тегло (3000 до 160 000), извлечен от червени водорасли, Rhodofíceas, главно от рода Gelidium. Състои се от галактозиди, които образуват агароза, и от сулфатиран полизахарид, агаропектин. Също така, той съдържа много малки количества катиони като примеси (Na, K, Ca, Mg и др.). Съставът му варира леко в зависимост от вида, от който е извлечен, произхода му, времето на прибиране, зрелостта на водораслите и др. Процесите на получаване и пречистване за получаване на различните видове агар влияят главно върху съдържанието на примеси.

Основната характеристика, която прави агара желиращ агент, е пълното му разтваряне във вода при нагряване до 85-100 ºC и желирането му при около 35 ºC. Той е термообратим, т.е. може многократно да се разтваря повторно и да се желира от вариации в температурата и е автоклавируем. Неговото желиране зависи от рН на хранителната среда, като е оптимално за рН 5.4-5.7. Културната среда за растителни тъкани обикновено се регулира до рН = 5,7 преди добавяне на агара, така че те да се стопят добре; след желиране агарът абсорбира количество вода до 200-300 пъти теглото си и образува много полупрозрачен гел. Приготвянето на хранителната среда за зеленчуци обикновено включва принос на агар от 0,8%.

Подробна информация за видовете агар може да се намери в различните търговски марки, например в този pdf

Сред алтернативните на агара съединения, които да се използват като желиращи средства в културата на ин витро растителна тъкан, имаме:

• Алгинати. Отличен за клетъчна суспензия и протопластна култура.

• Агароза. Той е един от полимерите на агара, който се получава от него. Използва се повече при електрофореза с протеини или нуклеинови киселини, отколкото в in vitro култура.

• Fitagel. Известен също с името gelrite, търговска марка на Merck; широко се използва.

• Ficoll. Това е полизахаридно производно, което произвежда колоидна културна среда. Намира важно приложение в културата на прашник.

Phytagel е анионен полизахарид, получен чрез бактериална ферментация. Гелът, който се образува, се характеризира основно с:

• Голяма прозрачност, която улеснява мониторинга на реколтата.

• Хранителната среда гелове с принос на фитагел само 0,2%

• За неговото желиране се изискват двувалентни катиони, главно Mg или Ca.

• Разтваря се и се гелира в отговор на промени в температурата, като агар, въпреки че не е термообратим.

• Експлантите, отглеждани в среда с фитагел, абсорбират хранителните вещества много лесно, което позволява по-бърз растеж, но скоростта на абсорбция може да е прекомерна и те не могат да бъдат включени в техните структури и съединения, но ще останат в разтвора в експланта, причинявайки проблема типично известен като хиперхидридност, често срещан при дървесните култури.

• Цената му е много по-ниска

Култивираните експланти инвитро те ще поемат съединенията заедно с водата от средата, която поглъщат, при условие че водният потенциал на експланта е по-отрицателен от осмотичния потенциал на средата. Осмотичният потенциал зависи от съединенията на средата, главно най-често срещаните: източника на въглерод, макроелементите (главно N и K) и желиращия агент, където е подходящо.

Приносът на източника на въглерод към осмотичния потенциал зависи от неговата концентрация. Желиращият агент има относително стабилен принос върху осмотичния потенциал, почти не се влияе от неговия тип или неговата концентрация, която трудно варира. Макронутриентите в културната среда също са важни за пълния им осмотичен потенциал.