Валидиране на in vitro модела на хранене с използване на ентерална формула в неутрофили

Кореспонденция на: Д-р М. Фариол.
Център за метаболитни изследвания и молекулярна биология (CIBBIM).
Обща болница Vall d´´Hebron.
Passeig Vall d'Hebron, 119-129.
08035 Барселона. Испания.
Имейл: [email protected]

Получено: 21.9.2002.
Прието: 30-I-2003.

Въведение

Неутрофилите бързо умират инвитро и да изпитате морфологичните промени, типични за клетките, подложени на програмирана клетъчна смърт 1. Културата на неутрофили предполага намаляване на тяхната жизнеспособност в рамките на часове, което ги прави отлични „тестови“ частици за изследвания върху стареенето на клетките. Да се ​​определят ефектите от храненето върху промените, причинени от стареенето на клетките, различни хранителни елементи, като аминокиселини, витамини, растежни фактори, липиди и др. се добавят към стандартни културни среди, обикновено като единични добавки, и се определя тяхната биохимична модулация на метаболитните пътища 2 .

Неспецифичният отговор на неутрофилите към инфекция е сложен. Сред многото замесени фактори е известно, че компонентите на клетъчната среда играят голяма роля. Липидният състав на средата има призната роля в възпалителния отговор, въпреки че няма консенсус относно степента на участие или значението на дължината или наситеността на мастните киселини в този контекст 3. В проучванията по този въпрос липидите се добавят като изолирани добавки на MCT, LCT или смеси от тези мастни киселини 4, 5. Към днешна дата обаче няма информация за метаболитните промени, настъпили в неутрофилните клетъчни култури след добавяне на търговски ентерални диети с липиди и други хранителни вещества.

Целта на това проучване е да потвърди модела на клетъчната култура, подходящ за оценка на ефектите на стандартните хранителни формули върху функцията на неутрофилите инвитро. По-конкретно, ние разработихме модел на остарели клетки, в който се оценява пълна търговска формула, съдържаща единствено LCT като липиден компонент и често използвана при гериатрични пациенти.

материали и методи

В предварителния етап ние определихме оптималната продължителност на културата и дозата на диетичната емулсия за целите на изследването чрез изследване на жизнеспособността на клетките и морфологичните промени. След като тези параметри бяха установени, ние изследвахме функционалността на неутрофилите чрез измерване на фагоцитоза, фрагментация на ДНК и липопероксидация. Всички експерименти бяха проведени най-малко три пъти.

Култура на неутрофили

Локва пълна кръв беше събрана след едно нощно гладуване от здрави доброволци на възраст от 18 до 55 години и неутрофилите бяха отделени от цяла кръв с Polymorphrep TM (разтвор на натриев метризоат/декстран, d = 1.113) при 1/2 (v/v) чрез центрофугиране при 1750 rpm в продължение на 30-35 минути при стайна температура. Пробата се промива с равен обем ClNa 0,45% и още два пъти с равни обеми физиологичен разтвор 0,9%. Червените кръвни клетки се лизират чрез смесване на гранулата в 10 ml студен буфер за лизис (155 mM NH 4 Cl; 10 mM KHCO 3; 0.1 mM EDTA; рН 7.4) в продължение на 10 минути. Неутрофилите се центрофугират, промиват се два пъти и се посяват в RPMI-1640 хранителна среда с L-глутамин и FCS 10% без антибиотици. Клетки с или без добавена диетична емулсия се инкубират в продължение на 18, 42 или 76 часа при 37 ° С в атмосфера от 5% CO 2.

Използвахме пълна стандартна ентерална диета (Cubitan; Nutricia Spain), съдържаща 3,5 g липиди на 100 ml, 14,2 g въглехидрати и 10 g протеини. Липидният състав е както следва: 97,1% растително масло (рапица и слънчоглед) и 2,9% млечна мазнина, което води до 98,7% триглицериди с дълга верига (LCT) и 1,3% триглицериди със средна верига (MCT). Моларността се изчислява, като се приема, че молекулното тегло на LCT е 865 далтона, както е описано 4. Използваните липидни концентрации се коригират в съответствие с протокола и са еквивалентни на 0,04, 0,08, 0,2 и 0,4 mM от LCT. В някои експерименти се добавят само по-високите дози от 0,2 и 0,4 mM LCT.

Клетъчна жизнеспособност и морфология

Клетките се оцветяват с Trypan Blue при 0,2% във физиологичен разтвор и се преброяват чрез светлинна микроскопия. Освен това клетките се оцветяват с May-Gr Grnwald/Giemsa и се изследва морфологията (х 100 светлинна микроскопия). За да се определи цитозолното увреждане, ензимната активност на лактодехидрогеназата (LDH) беше измерена в супернатантата чрез автоматизирана техника за спектрометрия, използваща пируват като субстрат и адаптирана към инструмента Hitachi 747.

Фагоцитоза

За това и всички следващи определяния, клетките първо се центрофугират, за да се получат гранули. Количественият NBT тест се провежда върху аликвотни части от 250 µL (2,5 х 105 клетки), смесени с 20 µL фосфатен буфер (PBS; рН 7,4) за нестимулираните проби или с 20 µL суспензия от латексни зърна (диаметър на частиците 1,094 µ, Sigma: LB-11) за стимулираните проби. Към всички проби се добавя 250 µL обем от 0,1% нитроблуй от тетразолий (Sigma: N-6876), разреден във фосфатен буфер (рН = 7,4). След 30 минути инкубация при 37 ° С реакцията се спира, епруветките се центрофугират при 3000 х g в продължение на 30 минути, супернатантите се изхвърлят и редуцираният NBT се екстрахира с диоксан (Sigma). Оптичната плътност (OD) беше измерена в супернатантите при 525 nm, като се използва диоксан като празна контрола, както е описано 6 .

Биохимични маркери

LDH активността беше определена в супернатантата (CV в хода: 3,8%) и концентрациите на йони на Na +, K + и Cl - бяха анализирани чрез автоматизирани методи за селективни електроди (Hitachi 787).

Производство на малонилдиалдехид

За освобождаване на MDA като маркер за липопероксидация използвахме аликвотни части от 2 х 106 клетки и количеството протеин в пробата беше определено. Клетките се лизират чрез замразяване 3 пъти в течен азот и водна баня при 37 ° С. Тиобарбитуровата киселина се добавя при 0,375% в 15% от TCA и 0,25N HCI и пробата се вари в продължение на 15 минути. След това се охлажда върху лед и MDA се екстрахира с бутанол. Пробата беше отчетена при 532 nm и бяха извършени изчисления, като се вземе предвид моларният коефициент на екстинкция ε = 1,56 x 105, както е описано 7, 8. Резултатите се изразяват на милиграм протеин (Pierce).

Реакция на дифениламин

Олигонуклеозомни ДНК фрагменти, получени при апоптоза, могат да бъдат отделени от не фрагментираната ДНК чрез центрофугиране. Това е основата на техниката, модифицирана от Wyllie 9, която дава количествена индикация за процента на фрагментирана ДНК в клетъчна популация. Апоптозата се оценява в аликвотни части от 12 х 106 клетки. Накратко, клетъчната пелета беше ресуспендирана с лизисен буфер (10 mM Tris, 20 mM EDTA, 0.5% Triton; pH 8.0) и след няколко етапа, включително хидролиза за 15 минути при 90 ° C, добавихме 240 mM дифениламин в леден оцет киселина и 0,01% (обем/обем) паралдехид бяха добавени. Пробите се инкубират при 30 ° С за една нощ и измерената абсорбция (595 nm) се сравнява от стандартна крива (телесна тимусова ДНК натриева сол; Sigma D-1501).

За анализ на данните са използвани дисперсионен анализ и тест на Wilcoxon (SPSS, 8.0). Значимостта беше зададена на ниво p от 10 .

Увеличението на фрагментацията на ДНК в култури с по-висока концентрация на LCT показва повишаване на клетъчната апоптоза (таблица III).

По отношение на производството на MDA като индекс на липопероксидация, клетъчните култури с 0,2 и 0,4 mM добавен LCT показват значителни намаления, които са по-големи при по-високата доза (таблица III).

Неутрофилната култура позволява изследване на биохимичните механизми и фармакологичните и хранителни ефекти, свързани с имунологичния отговор. Настоящото проучване валидира инвитро модел, предназначен да изследва ефектите на стандартна хранителна формула (съдържаща LCT липиди), върху функционалността на неутрофилите. След тестване на няколко културни периода, максималното време за култивиране е установено на 18 часа, времето, след което жизнеспособността на клетките започва да намалява 11. Значително увеличение на спонтанната апоптоза се наблюдава след 20 часа култивиране 12. В съгласие с предишни наблюдения, липсата на цитозолно увреждане в 18 часа се потвърждава от факта, че извънклетъчните нива на LDH, цитозолен маркер, използван в многобройни клетъчни модели, не показват промени по това време 13 .

Анализът на йони разкрива значително увеличение на извънклетъчния калий без промени в концентрациите на натрий. Описано е, че вътреклетъчното съотношение калий/натрий е индекс на жизнеността на клетките 10. Екскрецията на калий в средата с поддържана концентрация на натрий би понижила това съотношение, което би могло да се тълкува като индикатор за намалена жизненост на клетките, в съответствие със стария статус на клетките.

В човешки инвитро клетъчни изследвания, тестващи имуномодулиращите свойства на липидите, различни липидни емулсии се добавят към клетъчните култури като добавки. Използваните видове (LCT, MCT, LCT/MCT или структурирани) и количествата варират значително: 1,25 до 5,0 mmol/L 14, 0,00188 до 0,03% 5 (според нашите изчисления, еквивалентът на 0,075 до 1,2 mM), 2,5 mM на триглицериди на литър 15 и т.н. В настоящото проучване предоставените липиди са LCT, присъстващи в търговската ентерална диета. Концентрацията на ентералната диета в рамките на теста беше трудна за установяване, тъй като литературата не съдържа информация за използването на пълноценни диети инвитро. Избрахме дози от 0,2 до 0,4 mM, еквивалентни на приблизително 1/3 от концентрацията, използвана от Kruimel 14. Въз основа на своята оценка на данни от пациенти, лекувани с TPN 16, Kruimel смята инвитро концентрации от 1,25 mmol/l да бъдат физиологични. В предварителни експерименти (данните не са показани) тествахме тази концентрация в култура и установихме, че тя е прекалено висока, като изключва определянето на LDH. Така решихме за по-ниска концентрация.

Капацитетът на фагоцитозата на култивираните неутрофили показва незначително намаление с добавянето на различните количества диета, съдържаща LCT. Тази констатация е в съответствие с публикуваните резултати, при които добавянето на смеси MCT или MCT/LCT води до значително инхибиране на фагоцитозата, но само LCT води до по-умерено намаление 15 .

Методът на дифениламин, разделящ олигонуклеозомни ДНК фрагменти, получени по време на апоптоза, от не фрагментирана ДНК дава мярка за процента на фрагментирана ДНК в клетъчната популация. Тази техника не определя точния брой на апоптотичните клетки, но когато се комбинира с контролите, тя дава надеждна индикация за величината на клетъчната смърт, настъпила в културите. Резултатите от този анализ показват, че при 18 часа инкубация без добавяне на диета, 10% клетъчна фрагментация е настъпила спонтанно. С добавянето на 1% кубитан (v/v), еквивалентно на 0,4 mM LCT, процентът на фрагментация (често се счита за биохимичен отличителен белег на апоптозата) се е удвоил, но е регистриран и силно значителен спад в липопероксидацията; по този начин срещнахме две очевидно противоречиви констатации. Независимо от това, скорошно проучване предполага отделяне на фрагментацията на ДНК от други показатели на апоптоза в неутрофилите, което може да обясни това очевидно несъответствие. Авторите твърдят, че измерването на фрагментацията на ДНК само по себе си не е добър метод за оценка на промените, предизвикани от индуктори на апоптоза, като донори на азотен оксид 17 .

Парадоксално е, че се наблюдава намаляване на липопероксидацията с добавяне на по-висока концентрация на диетата. Обяснението за тези резултати е несигурно, но вярваме, че може да е свързано с наличието на по-големи количества антиоксиданти в ентералната диета (витамини, селен, таурин и др.), Които биха имали защитен ефект срещу оксидативен стрес, произведен по време 18 часа неутрофилно стареене.

В заключение, това е първото проучване, при което пълна търговска ентерална диета се добавя директно към културите, за да се изследват промените в клетъчната функция. Резултатите за фагоцитоза, фрагментация на ДНК и липопероксидация, получени с 0,4 mM LCT, предоставени като инвитро ентералната диета показва, че този модел на неутрофили адекватно отчита промените във функционалния капацитет на неутрофилите, протичащи по време на стареенето на клетките в резултат на хранителната модулация. Установените условия на култура не са прекалено взискателни, което прави тази система сравнително лесна за изпълнение и потенциално приложима за различни възрастови групи и патологични състояния.

Признание

Благодарим на г-жа Селин Кавало за съветите по английски език.

1. Colotta F, Re F, Polentarutti N, Sozzani S и Mantovani S: Модулация на преживяемостта на гранулоцитите и програмирана клетъчна смърт от цитокини и бактериални продукти. Кръв, 1992, 80: 2012-2020. [Връзки]

2. Hiroi M, Tajima M, Shimojima T, Kashimata M, Miyata T и Sakagami H: Anticancer Res, 1998, 18: 1813-1818. [Връзки]

3. Bellinati-Pires R, Waitzberg DL, Salgado MM и Carneiro-Sampaio MM: Функционални промени на човешки неутрофили чрез средноверижни триглицеридни емулсии: оценка на фагоцитозата, бактериалното убиване и окислителната активност. J Leukoc Biol, 1993, 53: 404-410. [Връзки]

4. Wanten GJA, Roos D и Naber AHJ: Ефекти на структурно различна липидна емулсия върху миграцията на човешки неутрофили. Clin Nutr, 2000, 19: 327-331. [Връзки]

5. Granato D, Blum S, R¶ssle C, Le Boucher J, Malnoe A и Dutot G: Ефекти на парентералните липидни емулсии с различен състав на мастните киселини върху функциите на имунните клетки in vitro. JPEN, 2000, 24: 113-118. [Връзки]

6. De la Fuente M, Del RÃo M, FernÃndez D и Hernà Anz A: Модулация на фагоцитната функция в перитонеални макрофаги на мишки от бомбезин, освобождаващ гастрин пептид и невромедин C. Имунология, 1991, 73: 205-211 [Връзки]

7. Запаси J и Dormandy TL: Автооксидацията на липиди на човешки червени кръвни клетки, индуцирани от водороден прекис. Br J Haematol, 1971, 20: 95-111. [Връзки]

8. Virgili N, Farriol M, Castellanos JM, GirGі M, Podzamczer D и Pita AM: Оценка на имунните маркери при пациенти с безсимптомни СПИН, получаващи добавки с рибено масло. Clin Nutr, 1997, 16: 257-261. [Връзки]

9. Wyllie AH, Kerr JF и Currie AR: Клетъчна смърт: значението на апоптозата. Int Rev Cytol, 1980, 68: 251-306. [Връзки]

10. Nkamgueu EM, Adnett JJ, Bernard J, Zierold K, Kilian L, Jallot E, Benhayoune H и Bonhomme P: In vitro ефекти на частици цирконий и алуминий върху макрофаги, получени от човешка кръв, моноцити; Рентгенова микроанализа и поточни цитометрични изследвания. J Biomed Mat Res, 2000, 52: 587-594. [Връзки]

11. Curi TCP, Demelo MP, Palanch AC, Miyasaka CK и Curi R: Процент на фагоцитоза, производство на O-2 (с централна точка) H2 O2 и NO и антиоксидантни ензимни активности на неутрофили на плъхове в културата. Cell Biochem Funct, 1998, 16: 43-49. [Връзки]

12. Majewksa E, Sulowska Z и Baj Z: Спонтанна апоптоза на неутрофили в пълноценна кръв и нейната връзка с генни протеини на апоптоза. Scand J Immunol, 2000, 52: 496-501. [Връзки]

13. Modriansky M, Ulrichova J, Bachleda P, Anzenbacher P, Anzenbacherova E, Walterova D и Simanek V: Хепатоцит на човека - модел за токсикологични изследвания. Функционална и биохимична характеристика. Gen Physiol Biophys, 2000, 19: 223-235. [Връзки]

14. Kruimel JW, Naber AH, Curfs JH, Wenker MA и Jansen JB: Със средноверижни триглицериди се получава по-високо и по-бързо производство на кислородни радикали чрез стимулирани полиморфно-ядрени левкоцити. JPEN, 2000, 24: 107-112. [Връзки]

15. Wanten GJA, Geijtenbeek TBH, Raymakers RAP et al.: Средноверижните триглицеридни съдържащи липидни емулсии повишават човешките неутрофили (2 експресия на интегрин, адхезия и дегранулация. JPEN, 2000, 24: 228-233. [Връзки]

16. Ball MJ: Парентерално хранене при критично болни: използване на средноверижна емулсия на триглицериди. Intensive Care Med, 1993, 19: 89-95. [Връзки]

17. Taylor EL, Megson IL, Haslett C и Rossi A: Дисоциация на фрагментацията на ДНК от други отличителни белези на апоптозата при третирани с азотен оксид неутрофили: разлики между отделните донорни лекарства за азотен оксид Biochem Biophys Res Com, 2001, 289: 1229-1236. [Връзки]

В Цялото съдържание на това списание, с изключение на случаите, когато е идентифицирано, е под лиценз Creative Commons

• Психология логопедично диетично хранене
• Валерия Дегенаро призна своята диета. Те вярват, че като модел като маруля - Diario Panorama
• Национални проучвания за храненето - Обединеното кралство Националните проучвания за храненето и храненето - Новини
• Научни статии - · 1 IX Чилийски конгрес по клинично хранене, затлъстяване и метаболизъм - PDF
• Валидиране на въпросника за емоционален ядец (CCE) в Чили