1 Център за изследвания в областта на храните и развитието, A.C. ИМОБИЛИЗАЦИЯ НА КИСЕЛИННИ ПРОТЕИ от стомаха на Сардина Монтерей (Sardinops sagax caerulea) В ПОДДРЪЖКИ НА ОСНОВА НА ХИТИН И ХИТОЗАН От: Jesús Aarón Salazar Leyva

център

6 ПОСВЕТЕНИЕ На моите родители: Мануел Салазар Чавес (Q.E.P.D.) и Мария дел Росарио Лейва Солорцано. Неговият велик пример за живот ме научи винаги да се стремя към повече. За моите братя: Карлос, Марисол и Харис. По някакъв начин всеки от вас е повлиял и ме е вдъхновил да постигна целите си и да продължа напред. Благодаря братя. На моите жени: Идалия, Камила и София. Те са моят двигател и най-големият източник на вдъхновение. Обичам ги. трион

7 СЪДЪРЖАНИЕ Страница СИНОПСИС. 1 ГЛАВА I. Преглед на състоянието на техниката на изследваната тема 17 ГЛАВА II. Проектиране на имобилизирана биокаталитична система, съставена от киселинни протеази, изолирани от сардински стомаси на Монтерей (Sardinops sagax caerulea) и подпори на основата на хитин и хитозан, получени от скаридови глави (Penaeus spp.) 40 ГЛАВА III. Получаване на оптимални условия на имобилизиране на протеази от сардинова киселина на Monterey (Sardinops sagax caerulea) върху частично деацетилирани хитинови опори. 52 ГЛАВА IV. Биохимична и оперативна характеристика на протеази от сардинова киселина на Monterey (Sardinops sagax caerulea), имобилизирани в частично деацетилиран хитин.79 ОБЩИ ЗАКЛЮЧЕНИЯ И ИЗСЛЕДОВАТЕЛСКИ ПЕРСПЕКТИВИ ЗАБЕЛЕЖКА: Страниците на глави I и II съответстват на оформлението, определено от списанието, където са публикувани статиите. vii

17, използван за проектиране на биокаталитична система, съставена от киселинни протеази, изолирани от сардински стомаси на Монтерей (Sardinops sagax caerulea), имобилизирани върху опори на основата на хитин и хитозан, получени от скариди (Penaeus spp.). 7

24 Глобален доклад за пазара на индустриални ензими: издание 2013 г. Goycoolea, F., Agulló, E., & Mato, R. (2004). Източници и процеси на възлагане. В: А. Абрам Пастор, Хитин и Хитозан: получаване, характеризиране и приложения Перу: Редакционен фонд на Папския католически университет в Перу. (P. ^ Pp Gupta, R., Beg, Q. и Lorenz, P. (2002 ). Бактериални алкални протеази: молекулярни подходи и промишлени приложения. Приложна микробиология и биотехнологии, 59 (1), Haard, NF (1992). Преглед на протеолитичните ензими от морски организми и тяхното приложение в хранителната промишленост. Journal of Aquatic Food Product Technology, 1 (1), He, S., Franco, C., & Zhang, W. (2013). Функции, приложения и производство на протеинови хидролизати от съпътстващи продукти за преработка на риба (FPCP). Food Research International, 50 ( ). Honarkar, H., & Barikani, M. (2009). Приложения на биополимери I: хитозан. Monatshefte für Chemie-Chemical Monthly, 140 (12), Janec ek, S. t. (1993). Стратегии за получаване на стабилни ензими. Биохимия на процесите, 28 (7), Khor, E., & Lim, LY (2003). Имплантируеми приложения на хитин и хитозан. Биоматериали, 24 ( 13), Курита, К. (2006). Хитин и хитозан: функционални биополимери от морски ракообразни. Морска биотехнология, 8 (3),

26 Рустад, Т. (2003). Използване на морски продукти от продукти. Електронен вестник по химия на околната среда, селското стопанство и храните (2). Rustad, T., Storrø, I., & Slizyte, R. (2011). Възможности за оползотворяване на морски странични продукти. International Journal of Food Science & Technology, 46 (10), Shahidi, F., & Janak Kamil, Y. (2001). Ензими от риби и водни безгръбначни и тяхното приложение в хранителната промишленост. Тенденции в науката и технологиите за храните, 12 (12), Sila, A., Nasri, R., Bougatef, A., & Nasri, M. (2012). Храносмилателни алкални протеази от бика (Zosterisessor ophiocephalus): Характеризиране и потенциално приложение като детергентна добавка и при депротеинизиране на отпадъци от скариди. Journal of Aquatic Food Product Technology, 21 (2), Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., & Lee, J.-K. (2013). От протеиновото инженерство до обездвижването: обещаващи стратегии за надграждане на индустриалните ензими. Международен вестник на молекулярните науки, 14 (1), Turk, B. (2006). Насочване на протеази: успехи, неуспехи и бъдещи перспективи. Отзиви за природата Откриване на наркотици, 5 (9),

27 ГЛАВА I Използване на материали на основата на хитин и хитозан при имобилизиране на протеази: ефекти върху тяхната стабилизация и приложения Преглед на статията, приета за публикуване в Мексиканския вестник по химическо инженерство 17

30 Salazar-Leyva et al./ Mexican Journal of Chemical Engineering Vol. 13, No. 1 (2014) xxx-xxx Фиг. 1. Методи за ензимно обездвижване, най-използвани днес. С течение на времето са разработени различни методологии за обездвижване на ензимите. Важно е обаче да се спомене, че не съществува универсална система за обездвижване, тъй като за даден случай е необходимо да се оценят различни методологии в зависимост от ензима, който трябва да се имобилизира, и процеса, в който трябва да се използва каталитичната система. Въпреки че различните процеси на обездвижване са концептуално различни, може да се каже, че те често са 3

50 ГЛАВА II Киселинни протеази от сардина Monterey (Sardinops sagax caerulea), имобилизирани върху отпадъци от скариди, хитин и хитозан: Търсене на каталитична система за страничен продукт Статия, публикувана в списание Applied Biochemistry and Biotechnology 40

56 800 Appl Biochem Biotechnol (2013) 171: Установени са значителни разлики в средствата при P 57 Appl Biochem Biotechnol (2013) 171: MWM Pepsin II Фиг. 1 Ензимен екстракт SDS-PAGE. Линия 1, маркери за молекулно тегло (MWM). Линия 2, полупречистен екстракт от кисели протеази от сардина Monterey стомашна адсорбция на протеини върху опори По отношение на PA, всички проучвания показват стойности над 65%. Наблюдавани са максимум% за CHSF и% за опори за имобилизиране на PDCHNF, активирани с 0.2% генипин (ковалентно обездвижване) (P 0,05) (Таблица 2). Според литературата възможностите за адсорбиране на протеина чрез различните носители, използвани в настоящото проучване, са приемливи. Предишно проучване съобщава, че топчетата от хитозан, омрежени с GA, адсорбират 72% от достъпната протеаза [26]. Междувременно, когато папаинът се свързва с хитогеновите хитозали, активирани с GA, се получава само 15,3% от ензимната адсорбция [27]. Други проучвания съобщават за по-ниски стойности на адсорбция на протеин (35%), когато липаза от Candida rugosa е била имобилизирана върху зърна от хитозан, активирани с 0,3% (p/v) 120 Ензимна активност (%) ph Фиг. на полупречистения екстракт от кисели протеази от сардина Monterey (S. sagax caerulea)

62 ГЛАВА III Оптимално обездвижване на киселинни протеази от сардина Monterey (Sardinops sagax caeurelea) върху частично деацетилиран хитин от отпадъци от главата на скариди Ръкопис, подготвен за изпращане в Journal of Aquatic and Food Product Technology 52

63 Оптимално обездвижване на киселинни протеази от сардина на Монтерей (Sardinops sagax caeurelea) върху частично деацетилиран хитин от отпадъци от скариди Глава: Оптимизационно обездвижване дава сардинови протеази Jesus Aaron Salazar-Leyva a, Jaime Lizardi-Mendoza a, Juan Carlos Ramirez-Suare Elisa Miriam Valenzuela-Soto a, Josafat Marina Ezquerra-Brauer b, Francisco Javier Castillo-Yañez b и Ramon Pacheco-Aguilar a * a Center for Research in Food and Development AC Carretera a la Victoria, C.P Hermosillo, Сонора, Мексико. b Катедра за изследвания и следдипломни изследвания в областта на храните, Университет на Сонора. Rosales y Niños Héroes S/N. Ермосильо, Сонора, Мексико. * Автор-кореспондент: Рамон Пачеко-Агилар Тел./Факс: адрес: 53

81 Tharanathan, R. и Kittur, F Chitin - безспорната биомолекула с голям потенциал. Крит. Rev. Food Sci. Nutr. 43: Tripathi, P. Kumari, A. Rath, P. and Kayastha, A. M Обездвижване на α-амилаза от боб Mung (Vigna radiata) върху Amberlite MB 150 и хитозанови мъниста: Сравнително проучване. J. Mol. Катал. B-ензим. 49:

82 Таблица 1 Оценени фактори и техните кодирани и действителни стойности, използвани в централната композитна конструкция Фактор Висока аксиална (+ α) Висока факториална (+1) Център (0) Ниска факториална (-1) Ниска аксиална Ензимно натоварване, mg/ml (X 1) ph на имобилизация (X 2) STPP,% (X 3) (-α) 72

83 Таблица 2 Изолиране на кисели протеази от сардина на Монтерей (Sardinops sagax caerulea) Стъпка на изолиране Общ протеин (mg) Обща активност (U) a Специфична активност (U/mg) Повишаване на чистотата Суров екстракт (NH 4) 2 SO 4 20% (NH 4) 2 SO 4 70% Диализиран екстракт a U = 1 μg тирозинов еквивалент, освободен от хемоглобина за минута 73

84 Таблица 3 Химичен състав (сухо тегло) от отпадъци от главата на скариди и извлечения хитин Проба Липиди Общ пепел Протеин Хитин азот Скарида глава 4,3 ± ± ± ± ± 0,1 отпадъци Хитин 0,56 ± ± ± ±

85 Таблица 4 Проектираща матрица и експериментални стойности на оценения отговор Фактори на действие Отговор Натоварване на ензима, mg/ml (X 1) ph на имобилизация (X 2) STPP,% (X 3) Добив от имобилизация (%)

86 Добив от имобилизация (%) Ензимно натоварване (mg/ml) a Имобилизационен добив (%) Имобилизация ph b Добив на имобилизация (%) STPP (%) c Фигура 1. Ефект на различни параметри върху добива от имобилизация на сардинови протеази (a) Ензимно натоварване (b) ph на имобилизация и (c) концентрация на натриев триполифосфат (STPP) 76

87 Таблица 5 Дисперсионен анализ (ANOVA) за вградения квадратичен модел за оптимизиране на добива на имобилизация Източник Степен на свобода F-стойност P-стойност (Prob> F) Модел * Натоварване на ензима, mg/ml (X 1) * Имобилизация ph ( X 2) STPP,% (X 3) X 1 * XX 1 * XX 1 * XX 2 * X * X 3 * X Липса на пригодност RR 2 adj 0,71 * Значителен при P стойност по-малка от

88 a b c Фигура2. Графики на повърхността на отговора за взаимните ефекти на условията на имобилизация върху добива на имобилизация. (а) ензимно натоварване и имобилизация ph, (b) ензимно зареждане и концентрация на триполифосфат, (c) имобилизация ph и концентрация на триполифосфат 78