Обобщение

ЦЕЛ: Да се ​​изследват инхибиторните ефекти на CT-II, екстракт от Nomame Herba, върху липазната активност in vitro и върху затлъстяването при плъхове, хранени с високомаслена диета in vivo .

ПРОЕКТИРАНЕ: Анализът за инхибиторния ефект на CT-II върху липазната активност се извършва чрез измерване на свободните мастни киселини, отделени след инкубация на средата с CT-II, свиня панкреатична липаза и триолеин (експеримент 1). В експерименти in vivo слаби или затлъстели плъхове (570–718 g) са хранени с високомаслена диета, съдържаща 60% мазнини със или без CT-II в продължение на 8 седмици (експеримент 2), в продължение на 14 дни (експеримент 3) или в продължение на 12 седмици (експеримент 4), съответно.

ИЗМЕРВАНЕ: времевият ход на телесното тегло, приемът на храна, телесното тегло (параметрични мазнини, черен дроб, сърце и бъбреци) и плазмените параметри (триглицериди, общ холестерол, глюкоза, AST, ALT и инсулин), общото количество на мазнините и общия холестерол измерена. Направени са и хистологични чернодробни изследвания.

Резултати: CT-II инхибира активността на свиня липаза по дозозависим начин in vitro (експеримент 1). Теглото на тялото и черния дроб бяха намалени и хистологичното изследване на черния дроб показа подобрение на мастния черен дроб при животни, лекувани с CT II (експеримент 2). CT-II значително инхибира наддаването на телесно тегло и повишаването на триглицеридите в плазмата по зависим от дозата начин, без да повлиява приема на храна при слаби плъхове, хранени с високомаслена диета. Повишените плазмени AST и ALT също намаляват (експеримент 3). Когато затлъстелите плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, са били лекувани с CT-II за период до 6 месеца, първоначално е намалено телесното тегло и впоследствие наддаването на тегло е значително елиминирано. Общо телесните мазнини също бяха значително намалени и се наблюдава значително намаляване на AST и ALT в плазмата (експеримент 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЯ: Тези резултати демонстрират, че инхибиторът на липазата CT-II е ефективен за предотвратяване и подобряване на затлъстяването, затлъстяването на черния дроб и хипертриглицеридемията при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини.

Достъпът е предоставен от

Въведение

Панкреатичната липаза е най-важният ензим за храносмилането на триглицеридите в храната. 1 Приложението на липазен инхибитор беше обсъждано преди това като лечение за затлъстяване. Орлистат (Ro 18-0647), хидрогенирано производно на липстатин, получено от Streptomyces toxitricini, е мощен инхибитор на стомашната, панкреатичната и карбоксилестер 2 липаза и е доказано, че е ефективен за лечение на човешко затлъстяване. 3, 4, 5 Съществуването на липазни инхибитори е изследвано в различни хранителни продукти и се съобщава за наличието на тези инхибитори в зърнените култури, в пшеничните трици и пшеничните зародиши 6 и в соята 7, 8. Инхибиторите на липазата са търсени и в естествени продукти като китайски лекарства и различни билки. 9

Бобово растение, Cassia mimosoides L. var. номаме Макино (Nomame Herba), отглежда се в Япония и Китай и традиционно се консумира като чай в Япония. По време на избора на липазни инхибитори сред естествените продукти, екстрактът от Nomame Herba показа забележителен инхибиторен ефект върху липазата. В настоящото изследване се изследва инхибиторният ефект на този екстракт CT-II върху активността на липазата in vitro и ефектите на затлъстяването при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини in vivo. .

Методи

Подготовка на CT-II

CT-II представлява фракция от водния етанолов екстракт от Nomame Herba, съдържащ предимно проантоцианидин (кондензиран танин). Приготвянето на фракцията беше както следва: 800 g от въздушната част на сухото растение бяха екстрахирани с 10 l 50% етанол (4 l, 3 l, 3 l, три екстракции). Екстрактът се подлага на Diaion HP 20 колона (Mitsubishi Chemical Corporation), промива се с 30% етанол и се елуира с 80% етанол. Елуираният разтвор се изпарява и лиофилизира до сухо, след което се получават 24 g CT-II прах. CT-II на прах се използва като смес с експериментална диета in vivo .

In vitro инхибиторен ефект на CT-II върху липазната активност

Анализът на липазната активност с използване на триглицериди като субстрат се извършва съгласно метода на Fukumoto et al. 10 В обобщение, инхибиторният ефект на (рН 7, 4) и 1 ml тетрахидрофуран (THF) 50% разтвор на CT-II се смесват в епруветка тип L (φ18 × 120 mm) и 1 ml от свинския разтвор. След това се добавя панкреатична липаза (Sigma тип II, 0.71 mg/ml като протеин в McIlvaine буфер) и се инкубира при 37 ° С в продължение на 15 минути с разклащане. Реакцията се спира чрез добавяне на етанол и освободените мастни киселини се титруват с 0,05 М NaOH. Празната проба се измерва, като се използва 50% THF без CT-II (експеримент 1).

In vivo ефекти на CT-II върху телесното тегло, телесните мазнини и метаболитите

Животни и диета.

В проучването са използвани женски плъхове Sprague-Dawley. Те бяха настанени в отделни клетки от неръждаема стомана при контролирана температура (24 ± 2 ° C) и на 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до вода и диета с високо съдържание на мазнини на прах, съдържаща 60% мазнини, 7,5% въглехидрати, 24,5% протеин (6,7 kcal/g), както в предишното проучване. 11 Нормалната диета, съдържаща предимно обезмаслено соево брашно и рибно брашно, се нарича екструдирана диета (CE-2, Clea Japan Inc.).

Процедури.

CT-II първоначално показва липазна инхибиторна активност в проучването in vitro. Тъй като прекомерният прием на хранителни мазнини допринася за развитието на затлъстяване, превантивните ефекти на екстракта върху развитието на затлъстяване са изследвани при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. След адаптиране към диетата с високо съдържание на мазнини и лабораторните условия в продължение на 1 седмица, постните плъхове с тегло между 239 и 251 g бяха разделени на две групи. На контролната група беше дадена само диета с високо съдържание на мазнини; Другата група е получавала диета с високо съдържание на мазнини със смесен CT-II в концентрация от 2,5%. Теглото на тялото се измерва всяка седмица. След 8 седмици лечение с CT-II, животните бяха умъртвени, теглото на органите беше измерено и органите бяха изследвани хистологично (експеримент 2).

След това бяха изследвани ефектите на дозата CT-II върху телесното тегло и плазмените метаболити при плъхове. Постните плъхове с тегло 265–298 g бяха разделени на шест групи. Контролната група е получавала само диета с високо съдържание на мазнини, както в експеримент 2. Останалите пет групи са получавали диета с високо съдържание на мазнини и CT-II, смесен в концентрации съответно от 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,5% и 3,5%. Телесното тегло беше измерено 4, 7, 11 и 14 дни след началото на лечението с CT-II, а дневният прием на храна беше измерен през 2-седмичния период на лечение. Впоследствие се взема кръв от вратната вена след 12-часово гладуване. Пробите се центрофугират и плазмата се отделя и замразява до анализ. Плазмените триглицериди (TG), общият холестерол (TC), глюкозата, аспартат аминотрансферазата (AST, EC 2.6.1.1) и аланин аминотрансферазата (ALT, EC 2.6.1.2) бяха измерени, като се използват процедурите, описани по-долу в „Анализи“ (експеримент 3) .

И накрая, беше оценено дали CT-II може да намали затлъстяването при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Плъхове, при които затлъстяването е предизвикано от диетата с високо съдържание на мазнини, с тегло 570–718 g, са разделени на две групи. Контролната група (средно телесно тегло, 643 g) продължава да приема само тази диета. Втората група (средно телесно тегло, 641 g) е получила диета с високо съдържание на мазнини със CT-II, смесена в концентрация 2,0%. Теглото на тялото се измерва седмично. След 4 седмици лечение, приемът на храна, общото производство на мазнини в изпражненията и общият холестерол във фекалиите се измерват за 3 дни. След 12 седмици лечение, кръвта се взима от сърцето след 12 часа на гладно и плазмата се отделя и замразява до анализ (TG, TC, глюкоза, AST, ALT и инсулин; експеримент 4).

есета

Глюкозата се анализира по метода на глюкозната оксидаза. Общият холестерол (TC), триглицеридите (TG), аспартат аминотрансферазата (AST) и аланин аминотрансферазата (ALT) се анализират чрез сух химически автоанализатор (AU-5200, OLYMPUS). Инсулинът се определя чрез имунологичен анализ. Измерваха се 12 телесни тегла (параметрични мазнини, черен дроб, сърце и бъбреци) и се записаха като процент от крайното телесно тегло, заедно с абсолютните стойности. Общата трупна мазнина се определя чрез извличане на лиофилизиран хомогенат от трупа без кожата. Трупът беше одран и подлепващите по кожата подкожни мазнини бяха остържени с остър нож или шпатула. Трупът без кожа и подкожната мазнина се комбинират и хомогенизират чрез двукратно преминаване през месомелачка (Meat Mincer β10, BONNY Inc.) с 3,2 mm мрежеста плоча и след това лиофилизиране. Екстракцията на липиди от лиофилизирания хомогенат на трупа без кожа се извършва по метода на Folch 13 и екстрактите се изпаряват под вакуум и се претеглят. Общото съдържание на мазнини се изчислява като абсолютна стойност и процента от крайното телесно тегло.

Статистически анализ.

Данните се изразяват като средно ± se и се анализират чрез тест ANOVA на Student и Aspin-Welch или се повтарят еднопосочно ANOVA, когато е подходящо; Стойност на p

инхибитор

Ефект на CT-II върху липазната активност. Активността на липазата се измерва като се използва свински панкреатична липаза и триолеин като субстрат. Инхибиторният ефект е показан като намаляване на относителната активност (%) спрямо липазната активност на контролата (0 mg/ml CT-II).

Изображение в пълен размер

Фигура 2 показва скоростта на нарастване на телесното тегло на слаби плъхове, хранени с високомаслена диета със или без CT-II (експеримент 2). Прирастът на тези, хранени с диета, съдържаща 2,5% CT-II, беше значително потиснат от 1 до 8 седмици по време на лечението (P

Ефект на CT-II върху наддаването на телесно тегло при слаби плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Стойностите са средната стойност ± se (%) (n = 6). Промените в наддаването на телесно тегло за всеки период на лечение са показани като процент от изходното телесно тегло. (•) контрол; (▴) CT-II 2, 5% в диетата. *** Посочете значителни разлики в t-теста на Student и Aspin-Welch, които сравняват 2,5% от групата CT-II с контролната група (0% от CT-II) (* P

Сравнение на чернодробната хистология при слаби плъхове, хранени с високомаслена диета след 8 седмици лечение с CT-II. Много мастни капчици, показващи се като големи бели сфери в необработени контроли, бяха премахнати или намалени по размер.

Изображение в пълен размер

Дозозависимите ефекти на наддаването на телесно тегло на плъхове, хранени с високомаслена диета със и без CT-II, са показани в Таблица 2. CT-II потиска наддаването на телесно тегло по зависим от дозата начин. Степента на наддаване на тегло при четирите групи, хранени с диета, съдържаща 1,0-3,5% CT-II, беше значително потисната (P

Ефект на CT-II върху наддаването на телесно тегло при затлъстели плъхове, хранени с високомаслена диета. Стойностите са средната стойност ± se (%) (n = 6). Промените в наддаването на телесно тегло за всеки период на лечение са показани като процент от изходното телесно тегло. (•) контрол; (▴) CT-II 2,0% в диетата. *** Посочете значителните разлики в t-теста на Student и Aspin-Welch, които сравняват 2,0% от групата CT-II с контролната група (0% от CT-II) (* P 2,14 и е доказано, че -обезна и антихиперхолестеролемична активност при различни животински модели, 15, 16 и при хора.3, 4, 5 Съобщава се, че се получава 50% инхибиране на липазната активност от 0,63 до 0,6 85 до 0,1 μg/ml частично пречистена свиня панкреатична липаза в система за анализ на липаза

В експеримент 2, прилагането на CT-II инхибира увеличаването на телесното тегло при слаби плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, в зависимост от дозата. Това инхибиране не зависи от намаляването на приема на храна, тъй като няма разлика в количеството консумирана храна между плъхове, лекувани с CT-II и нелекувани с CT-II. TG на плазмата също е намалена в зависимост от дозата. AST и ALT бяха намалени след 2 седмици лечение с CT-II, а чернодробната хистология след 2 месеца лечение показа подобрение в затлъстяването на черния дроб. Резултатите също така показаха, че лечението с CT-II предотвратява затлъстяването на черния дроб.

Тестът за баланс между приложената мазнина и мазнините, екскретирани в изпражненията след 4-седмично лечение показва увеличение на последното, което предполага инхибиране на интрагастроинтестиналната липаза чрез CT-II, което би довело до потискане на хидролизата и абсорбция триглицериди, както е показано in vitro в настоящото проучване. Следователно инхибирането на активността на панкреатичната липаза също е демонстрирано in vivo. Екскрецията на холестерол във фекалиите също се е увеличила. THL инхибира холестеролестеразната и липазната активност. Следователно, има възможност инхибирането на холестерола II-холестерол CT-II да бъде потиснато от инхибирането на холестерола. CT-II обаче не понижава плазмения холестерол, въпреки че увеличава отделянето на холестерол в изпражненията, така че са необходими повече изследвания, за да се разбере това наблюдение.

Неблагоприятен ефект на липазния инхибитор THL е много честата поява на диария при хората. 3, 5 Въпреки това, плъховете, лекувани с CT-II в настоящото проучване, не показват диария или необичайна химия в кръвта, което предполага, че екстрактът има по-малко неблагоприятни ефекти от THL.

В обобщение, липазният инхибитор CT-II е ефективен за предотвратяване и подобряване на затлъстяването, затлъстяването на черния дроб и хипертриглицеридемията при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Резултатите предполагат, че CT-II може да бъде полезно вещество за предотвратяване и лечение на затлъстяване и хипертриглицеридемия при хората.