Субекти
Обобщение
Морските гъби са древни, приседнали, филтриращи метазони и представляват важен компонент на бентосните общности по света. Гъбите съдържат забележително разнообразие от бактерии, но малко се знае за функционалните свойства на такива бактериални симбионти. В това изследване представяме геномната и функционална характеристика на некултивирана δ-протеобактерия, свързана с гъбата Cymbastela koncentrica. Ние показваме, че този организъм представлява нова филогенетична клада и предлагаме той да живее заедно с цианобактерия. Ние също така предоставяме общ преглед на прогнозираните функционални и екологични свойства на тази δ-протеобактерия и обсъждаме нейните сложни взаимодействия с околните клетки и околната среда, включително чертите на прикрепване на клетките, транспорта на хранителни вещества и протеиновите протеинови взаимодействия.
Въведение
материали и методи
Филогенетичен анализ
Първоначалната таксономична класификация на протеинобактериалната 16S рРНК генна последователност беше проведена с помощта на алгоритъма на Байесов класификатор с предварително определени параметри в проекта за рибозомна база данни (Wang et al., 2007; Cole et al., 2009). Най-близките съседни последователности (както за некултивирани, така и за изолирани представители) на rS-протеобактериалната 16S генна последователност бяха извлечени от Ribosomal Database Project версия 10 с помощта на функцията seqmatch и след това подравнени с помощта на SINA web aligner (Pruesse et al., 2007). Изградено е филогенетично дърво, използващо алгоритъма за максимална вероятност с 16S rRNA генни последователности с пълна дължина (> 1200 nt) в софтуерния пакет ARB (Ludwig et al., 2004). За да се избегне използването на силно променливи региони за сравнения, бяха използвани маска за позиционна променливост на отбор (pos_var_Bacterias_94) и специфична за потребителя крайна маска, което доведе до сравнението на 1178 нуклеотида в дървесната конструкция. Необразован евриархеот. (Genbank Accession: AB077227) е използван като външна група при изграждането на дървото.
Геномна и сравнителна геномна реконструкция.
Частичният геном на протеобактериалните видове е реконструиран чрез обединяване на данни за секвениране на пушки от бактериалната общност на гъбата C. koncentrica (Thomas et al., 2010). Клъстерирането на скелета с последователност> 20 kb се извършва съгласно модификация на стратегията, описана от Woyke et al. (2006) и Thomas et al. (2010) и е описана по-подробно в Допълнителната информация.
Локализация на δ-протеобактериум
Проби от морската гъба на C. koncentrica са събрани в залива Ботани, близо до остров Баре, Сидни, Австралия (S 33.59.461; E 151.13.946) през август 2009 г. След събирането тъканта на C. koncentrica е изплакната с калций и без магнезий. морска вода (25 g NaCl, 0,8 g KCl, 1 g Na2SO4, 0,04 g NaHCO3 на 1 L) и незабавно прехвърлени в 15% разтвор на захароза. Пробите бяха прехвърлени обратно в лабораторията върху лед в рамките на 1 час. Извършва се флуоресцентна in situ хибридизация (FISH), както е описано в допълнителната информация с валидирани сонди, насочени към бактерии като цяло и специфично към δ-протеобактерии.
Резултати и дискусии
Нова актер-протеобактериална клада от свързани с гъба бактерии
Дърво с максимална вероятност на 16S rRNA генната последователност на δ-протеобактериум от C. koncentrica и сродни организми. Дървото е построено върху 1178 нуклеотида от гена 16S rRNA. Необразован евриархеот. (AB077227) е използван като външна група за анализ (не е показан в дървото). Скалата показва 0,1 нуклеотидни промени (10%) на нуклеотидна позиция. U, необразован; Аз, изолациите.
Изображение в пълен размер
Асоциираната с гъба група проте-протеобактерии също се отличава от родовете Desulfuromonas и Bacteriovorax, с нива на дивергенция съответно 24% и 30%. Родът Desulfuromonas съдържа водни видове, за които е известно, че растат анаеробно чрез окисление на ацетат с едновременно намаляване на елементарна сяра или Fe (III) (Pfennig and Biebl, 1976). Видовете бактериоворакс паразитизират върху други грам-отрицателни бактерии и имат силно подвижна, свободно живееща извънклетъчна фаза, през която търсят нови гостоприемници. Фенотипните характеристики на този род са идентични с тези на Bdellovibrio и Bacteriovorax наскоро беше прекласифициран като отделен род въз основа на филогенията, основан на 16S рРНК гена (Baer et al., 2000, 2004).
Извършеният тук филогенетичен анализ показа, че C. koncentrica δ-протеобактериите вероятно представлява нов род или семейство и че членовете на тази група бактерии, които предстои да бъдат култивирани, са свързани с гъби.
Функционално геномно сравнение на гъбата протеобактерии със сродни бактерии
Функционално сравнение на генома въз основа на COG категориите на δ-протеобактериум частичен геном и геномите на генома на B. bacteriovorus HD100 ( да се ) и D. ацетоксидани DSM684 ( б ). Оста Y показва средната стойност със значителна гранична стойност от -2 и 2.
Изображение в пълен размер
За да разберем дали някои функции на протенобактериалния геном имат обща еволюционна история със сродни геноми, класифицираме всички негови протеини таксономично с алгоритъм с по-нисък общ прародител, внедрен в MEGAN (Huson et al., 2007). Таксономичен анализ на 663 протеина показа, че 249 могат да бъдат присвоени на B. bacteriovorus HD100, 4 на D. acetoxidans DSM684, 185 не са имали посещения в базата данни без излишни GenBank, а останалите протеини са били назначени на различни нива в рамките на бактерии или просто клетъчни организми (допълнителна таблица S4). Тези резултати показват, че протеномът на протеобактериум споделя повече запазени протеини с генома на B. bacteriovorus HD100, отколкото всеки друг наличен геном.
Това показва, че в допълнение към прикрепването и подвижността, процесът на биогенеза на клетъчната стена е и еволюционно запазена функция на протеобактериалната гъба и B. bacteriovorus .
Гъбата проте-протеобактерии проявява свързан с клетките начин на живот
Сходството, открито в подвижността, привързаността и биогенезата на клетъчната стена в сравнение с B. bacteriovorus, ни доведе до хипотезата, че гъбата протеобактериум също може да образува асоциация (потенциално хищническа по природа) с други бактериални клетки. Следователно, ние изследвахме физическото местоположение на ob-proteobacterium в гъбата чрез флуоресцентна in situ хибридизация. Използвайки сонда за бактериалния домен (EUB338), първо демонстрирахме наличието на голям брой бактерии в гъбата C. koncentrica (Фигура 3а). Сонда, насочена срещу 16S рРНК последователността на δ-протеобактерия, доведе до откриване на малки клетки (3 µm на дължина) и само от време на време се открива като свободно живи клетки (Фигури 3b и c). Относителният дял на δ-протеобактериум спрямо общата микробиота се оценява на 6,4% ± 1,8% (вж. Допълнителна информация), което е подобно на 2,2% ± 0,8% от последователностите, открити в три 16S рРНК генни PCR библиотеки, които принадлежат на al δ -proteobacterium (Thomas et al., 2010). Местоположението на проте-протеобактериите често е в края на по-големите автофлуоресцентни клетки.
Изображение в пълен размер
Авто-флуоресцентните клетки-гостоприемници показват зелена автофлуоресценция, когато се възбуждат с 488nm светлина, което е в съответствие с флуоресценцията, съобщена за цианобактерии, диатомити и динофлагелати (Tang and Dobbs, 2007). За да определим дали автофлуоресцентните клетки са еукариотни (т.е. диатомове или динофлагелети) или бактериални (т.е. цианобактерии), извършихме допълнителен FISH анализ, използвайки двусондов хибридизационен дизайн с Cy3-маркирана сонда, специфична за проте-протеобактериум и флуоресцеин изотиоцианат -белязана с бактерии специфична сонда. Фигура 3d показва, че автофлуоресцентните клетки реагират на общата бактериална сонда. Следователно, въз основа на специфичната автофлуоресценция и свързването на сонда, специфична за бактериите, тези клетки вероятно са цианобактерии. Това откритие е в съответствие с наблюдение, направено преди 30 години от Уилкинсън (1979), който открива частици, подобни на Bdellovibrio, с помощта на електронна микроскопия, в едноклетъчни цианобактерии в мезоила на двете коралови гъби, Neofibularia irata и Jaspis stelifera. .
Очаквани функционални свойства на δ-протеобактериалната гъба
За да разберем по-добре функционалните свойства на новата нова протеобактерия, извършихме внимателен ръчен анализ на нейния частичен геном по отношение на физиологичните и екологичните функции.
Идентифицирахме субединиците на крайния ензим в аеробната дихателна верига, цитохром С оксидаза, в частичния геном (1108814258778_ORF0001). Следователно гъбата с протеобактерии може да расте аеробно; допълнително го разграничава от сродни строго анаеробни видове Desulfuromonas.
Схематично представяне на ORF, кодиращи AR и TRP протеините в скелето δ-протеобактериум 110814258323. ORF са показани със стрелки с относителни нуклеотидни позиции.
Изображение в пълен размер
Заключения
Ние сме идентифицирали и характеризирали чрез независими от културата подходи нова протеобактерия, която вероятно представлява нов род или семейство. Доколкото ни е известно, този асоцииран с гъба организъм представлява само третата група асоциирани с гостоприемника проте-протеобактерии. Предлага се гъбата протеобактериум да живее заедно с цианобактериите и вероятно да окаже влияние върху физиологията на своя фотосинтетичен гостоприемник. Това от своя страна може да има последици за гостоприемника, който често съдържа фотосинтетични симбионти и следователно придобива фотосинтетично фиксиран въглерод (Venn et al., 2008). Функционалната геномна характеристика на некултивираните δ-протеобактерии, описана тук, също показва сложни взаимодействия с околните клетки и околната среда. Това проучване предлага представа за взаимодействията на много нива между гъбата, която служи като гостоприемник за цианобактерия, която от своя страна е гостоприемник за проте-протеобактерия.