Университет в Гранада Институт по биотехнологии Ръководена изследователска работа за получаване на заглавие: магистър по биотехнологии Характеризиране на протеиновия профил на ентомопатогенен щам на Bacillus pumilus. Даяна Каролина Гарсия Рамон, юли 2011 г.
Университет в Гранада Институт по биотехнологии Ръководена изследователска работа за получаване на заглавие: магистър по биотехнологии Характеризиране на протеиновия профил на ентомопатогенен щам на Bacillus pumilus. Диана Каролина Гарсия Рамон, юли 2011 г. Учител: Съучител: Д-р Сузана Вилчес Торнеро Нает професор доктор Катедра по биохимия Институт по биотехнологии Университет в Гранада Д-р Антонио Осуна Карило де Алборноз Професор от Университета в Гранада Катедра по паразитология Университет в Гранада
Част от резултатите от тази изследователска работа са представени на 13-ата Европейска среща на конгреса на работните групи на IOBC/WPRS, чрез устно представяне, със заглавие: Разбиране на токсичността на Bacillus pumilus 15.1 спрямо средиземноморската плодова муха (Ceratitis capitata). Място: Инсбрук Австрия Дата: 19-23 юни 2011 г.
ИНДЕКСНИ ПРИЗНАВАНИЯ. ИНДЕКСИРАМ. V РЕЗЮМЕ. 1 СЪКРАЩЕНИЯ. 5 1. ВЪВЕДЕНИЕ. 9 1.1 Ентомопатогенни микроорганизми. 11 1.2 Ентомопатогенни бактерии. 13 1.2.1 Родът Bacillus. 14 1.2.2 Bacillus thuringiensis. 15 1.2.2.1 Фактори на вирулентност: Cry и Cyt токсини. 17 1.2.2.2 Други фактори на вирулентност. 19 1.2.2.3 Биотехнологични приложения. 21 1.3 Bacillus pumilus. 22 1.3.1 Биология. 22 1.3.2 Биотехнологични приложения. 24 1.3.2.1 Производство на ензими. 24 1.3.2.2 Производство на антибиотици. 26 1.3.2.3 Биологичен контрол. 27 1.3.2.3.1 Контрол на гъбичките и бактериите в растенията. 27 1.3.2.3.2 Контрол на насекомите. 30 1.3.2.4 Други приложения. 32 1.4 Bacillus pumilus 15.1. 32 2. ЦЕЛИ. 37 3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ. 43 3.1 Условия за култивиране на бактериални щамове. 45 3.1.1 Бактериални щамове и тяхното опазване. 45 3.1.2 Културни среди. 46 3.1.2.1 Богата среда. 46 3.1.2.2 Спорулационна среда. 46 3.1.3 Условия за отглеждане. 47 3.2 Анализ на протеини. 47 3.2.1 Обработка на протеинови проби. 47 3.2.2 Протеинова електрофореза. SDS-PAGE. 3.2.3 Разделяне на протеините чрез захароза Градиент. 50 3.2.4 Микроскопия. 51 3.2.4.1 Оптична микроскопия. 51 3.2.4.2 Трансмисионна електронна микроскопия. 52 3.2.5 Имуноблоти. 52 3.2.6 Разтваряне на протеини. 54
3.2.7 Анализ и идентификация на протеини чрез MALDI-TOF. 56 3.2.8 Биопроби с C. capitata. 56 3.2.8.1 Поддържане на колонията от средиземноморски плодови мухи. 56 3.2.8.2 Биопроби с ларви. 58 4. РЕЗУЛТАТИ. 63 4.1 Протеинов профил на щама B. pumilus 15.1. 65 4.1.1 Протеинов профил на вегетативна култура. 66 4.1.2 Протеинов профил на спорообразна култура. 67 4.2 Разделяне на протеини чрез захарозни градиенти. 70 4.3 Наблюдение на B. pumilus 15.1 чрез микроскопия. 79 4.4 Анализ на фракциите от култура на B. pumilus 15.1 с използване на Имуноблот. 85 4.5 Разтваряне на протеини. 88 4.6 Идентифициране на протеини чрез пептиден анализ на пръстови отпечатъци или отпечатване на пръсти. 4.7 Активност на изолирани протеини в градиенти на захароза срещу ларви на C. capitata. 95 5. ДИСКУСИЯ. 99 6. ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 109 7. БЪДЕЩА РАБОТА. 115 8. БИБЛИОГРАФИЯ. 121 ПРИЛОЖЕНИЯ. 141 Анализ и идентификация на протеини чрез MALDI-TOF. 143 37 kda протеин. 143 Протеин 17 kda. 144 Протеин 45 kda. 145 Протеин 60 kda. 146 Протеин 250 kda. 147
СЪКРАЩЕНИЯ (p/p) Съотношение тегло/тегло (p/v) Съотношение тегло/обем (v/v) Съотношение обем/обем
Приблизителни C градуса Целзий µg Микрограми µl Микро литри µm Микро метър 16S Прокариотна рибозома минорна субединица рРНК молекула ДНК Дезоксирибонуклеинова киселина APS Амониев персулфат РНК Рибонуклеинова киселина рРНК рибозомна РНК ATP Аденозин трифосфат Bturingin Bt. Цитолитен протеин Da Daltons DNAse Дезоксирибонуклеаза DTT Дитриотритол EDTA Етилендиаминтетраоцетна киселина g Грами H 2 O 2 Водороден пероксид HCl Солна киселина K 2 MnO 4 Калиев манганат kb Кило основи 5
kda LM ma mg ml mm mm MS - MS PBS ph PMSF RNase rpm SDS SDS-PAGE TEMED CFU V Vh W xg Kilo Daltons Liter Моларна концентрация Мили ампери Мили литри Мили метри Мили моларен Метод на пептидна фрагментация в мас спектрометрия Буфер Солен фосфат Водороден потенциал Фенилметилсулфонил флуорид Рибонуклеазни обороти в минута Натриев додецил сулфат Натриев додецил сулфат полиакриламиден гел електрофореза N, N, N, N-тетраметилетилендиамин Единици, образуващи колонии Волти Относително английско напрежение в залата Ват или Ват сила Относителна центробежна сила
1. ВЪВЕДЕНИЕ 9
Въведение ABCDEFF Фигура 1.1 Различна морфология на параспоралните кристали: ромбоиден (A), дипирамиден (B), хетерогенен (C) (Kaelin et al. 1994), сферичен (D), неправилен (E) (Karamanlidou et al. 1991) и кубичен (F) (Ramalakshmi and Udayasuriyan 2010). 1.2.2.1 Фактори на вирулентност: Cry и Cyt токсини Групата δ-ендотоксин се състои от две групи протеини, които нямат хомология на последователността или третичната структура: протеините Cry (от английския Crystal) и протеините Cyt ( от английския Cytolitic). Към днешна дата са клонирани и секвенирани 572 различни гена за плач и 35 гена за цит (Crickmore et al. 2011). Всеки δ-ендотоксин има характерен спектър на инсектицидна активност, с обхват на действие, ограничен до няколко вида, обикновено от същия ред. Този спектър може да зависи от комбинацията от δ-ендотоксин, която щамът произвежда. Описани са голям брой δ-ендотоксинови генни комбинации, като най-много са 17
със същите характеристики е B. pumilus T4, който предизвиква резистентност при Arabidopsis срещу Pseudomona syringae (Ryu et al. 2003). Механизмът на действие на някои щамове на B. pumilus за индуциране на резистентни системи в растенията е доста добре разбран. Например, при захарно цвекло, B. pumilus 203-6 и 203-7 индуцират системна резистентност чрез увеличаване на производството на хитиназа и β-1,3-глюканаза (Bargabus et al. 2004); При тютюна резистентността, медиирана от B. pumilus SE34, се определя от повишените нива на салицилова киселина (Zhang et al. 2002), докато при граха същият този щам предизвиква резистентност чрез укрепване на епидермалните клетъчни стени и кората чрез производството на калоза и фенолна киселина съединения (Choudhary and Johri 2009). По този начин индуцирането на системна резистентност при растенията от B. pumilus, подобно на други от неговите видове, зависи от бактериалния щам, растението гостоприемник и в някои случаи от патогена (Choudhary and Johri 2009). Няколко примера са описани в литературата (Таблица 1.2). Това приложение е индустриално експлоатирано и има няколко продукта за продажба, чиято активна съставка е щам на B. pumilus (Таблица 1.3). 28
Въведение Таблица 1.2 Използване на B. pumilus за биологичен контрол на растителните патогени. Bacillus pumilus Щам Растителна болест Патоген 203-6 и 203-7 Захарно цвекло Листно петно от Cercospora Cercospora beticola SE34 и T4 Тютюн Синя плесен Peronospora hyoscyami pv. табазин INR7 Краставица Бактериално увяхване Erwinia tracheiphila SE34 Домат Лист петна Краставица мозайка вирус (CMv) SE34 Домат Късна болест Phytophthora infestans INR7, SE34, SE39, SE52 Тамян бор Fusiform ръжда Cronartium quercuum, Miyabe exsirai f. sp. Fusiform INR7 Краставица ъглово петно Pseudomona syringae SE34 Домати Leaf spot T4 Tobacco Wildfire Tomato mottle virus (ToMov) Pseudomona syringae pv. тютюн Източник: (Choudhary and Johri 2009). 29
Таблица 1.3 Търговски продукти за биологичен контрол в растения на базата на B. pumilus Марка/наименование на продукта B. pumilus щам Патоген/болест GB34 Биологичен фунгицид GB34 Rhizoctonia и Fusarium Ballad QST2808 Соева ръжда от Азия Sonata B. pumilus Брашнеста мана, мана, ранна болест, късна болест, кафяво гниене, пожар. Щит за добив GB34 Патогенни гъби, причиняващи болести на корените. Източник: Комитет за биологичен контрол на APS (http://www.oardc.ohio-state.edu/apsbcc/) 1.3.2.3.2 Контрол на насекомите Традиционно B. pumilus не се счита за ентомопатогенен вид. Въпреки голямото разнообразие от полезни биологични дейности, които са демонстрирани, неговите приложения се фокусират върху използването на биоплагициди за профилактика и лечение на заболявания, причинени от фитопатогенни гъби, главно в корените на някои култури. Проучванията обаче демонстрират патогенността на щамовете B. pumilus срещу насекоми-мишени (Heins et al. 1999; Eryurk et al. 2008; Molina et al. 2010; Yaman et al. 2010). 30
Въведение През 1999 г. Heins et al. Патентоват метод за защита на растенията срещу царевичния червеев червей (Diabrotica virgifera, D. longicornis, D. undecimpunctata), зеленият червеник от понички или цвекло (Spodoptera exigua) и някои видове нематоди, чрез прилагане на определено количество супернатант, получен от пълна култура на B. pumilus AQ717 върху която и да е част от растението, включително корените или приложенията върху околната почва. Споменатият патент включва щам B. pumilus AQ717, метаболитите с пестицидна активност, произведени от щама и различни методи за защита и третиране на растенията срещу тези насекоми, или чрез използване на суспензия на бактериалната култура, супернатанта на културата или пречистения метаболит. Патентът описва производството на разтворим и токсичен метаболит с ниско молекулно тегло (
- Сачма от зеленчуков шейк от малина, 30 гр. Нулеви съжаления
- Чип за хранителен генетичен профил (Nutrichip) - LAB DURAN BELLIDO
- Протеинови шоколадови зимни подправки и бадемови бисквитки Ограничено издание
- Обвинен в изнасилване е оправдан, тъй като жертвата е със затлъстяване Профил
- 20 здравословни и бързи закуски за запомняне - списание Profile