Обобщение

Пневмонектомията на левия гризач е ценна техника за изследване на белодробна хипертония. Тук представяме протокол за описание на процедурата за пневмонектомия на плъхове и следоперативни грижи за минимална заболеваемост и смъртност.

лявата

Резюме

Въведение

Белодробната артериална хипертония (БАХ) е прогресиращо и фатално заболяване, характеризиращо се с повишен белодробен кръвоток, повишено съдово съпротивление, възпаление и ремоделиране на малки белодробни кръвоносни съдове. Това ремоделиране обикновено води до съдови лезии, които запушват и изтриват малки белодробни артерии, причинявайки вазоконстрикция и увеличено допълнително натоварване на дясната камера 2. Има някои успешни фармакологични лечения на БАХ; в резултат на това PAH остава с висока смъртност. Напоследък фокусът на изследванията в патобиологията на белодробната хипертония се насочи към механизъм, при който ролята на увеличения белодробен кръвен поток се счита за важен фактор в развитието на белодробно съдово ангиопролиферационно ремоделиране 3, 4 .

Новостта на този ръкопис е представена в много подробния и пълен хирургичен протокол за лява пневмонектомия при плъхове и в обсъждането на техническите и физиологичните предизвикателства на тези модели. Тъй като в момента този протокол не е наличен, много изследователи смятат, че моделът е твърде труден. Изследователите, извършили лява пневмонектомия, са изправени пред висока смъртност и заболеваемост, свързани с ненужна загуба на животни, което компрометира научната оценка. Вместо това, много хора използват класически модели като MCT инжекция, хронична хипоксия или пневмонектомия, за да създадат PAH. Тези модели обаче са много по-малко ефективни от комбинацията на MCT или Sugen с лява пневмонектомия. Основната цел на тази статия е да предостави първия подробен и възпроизводим хирургичен протокол за едностранна лява пневмонектомия при плъхове и да осигури най-добрия хирургичен модел на ПАХ. Комбинирането на този протокол за лява едностранна пневмонектомия с MCT или SU5416 ще позволи на изследователите да създадат много по-ефективен и клинично значим модел на тежка PAH за изследване на патогенезата на това фатално заболяване.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Процедурите, описани по-долу, са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към Медицинското училище Icahn в планината Синай. Всички плъхове, получили хуманни грижи, отговарят на планината Синай "Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни".

1. подготовка за операция

  1. Cooley-Mayo автоклавни извити ножици (големи ножици), прави ножици Iris (малки ножици), Vannas McPherson Iris ножици (задни ножици), тъканни форцепс Wangensteen (атравматични форцепс), Gerald тъканни форцепс, обикновен телен спекулум (самосъхраняващо се прибиращо устройство), припалител за малки съдове, марлени подложки, двойна сонда, фин държач на съдови игла и хемостатичен форцепс от комари Jacobson Micro (комар).

2. подготовка и интубация на плъхове

3. стерилна подготовка на околната среда

  1. Визуализирайте хирургичната област под микроскоп. Това трябва да се направи първо, защото микроскопът не може да се регулира, след като средата е стерилна.
  2. Сложете стерилни хирургически ръкавици. Не докосвайте нищо друго освен стерилни инструменти, хирургически завеси и хирургичната област на тялото на плъха!.
  3. Поставете стерилна завеса върху тялото на плъха и върху таблата за инструменти, за да създадете стерилна среда.
  4. Носете стерилни ръкавици, поставете стерилни инструменти върху стерилната тава за инструменти.

4. Лява хирургична процедура Пневмонектомия

5. следоперативно възстановяване

  1. Поставете животното в гръдна позиция. Изключете изофлурана, но продължете да давате на плъха кислород през ендотрахеалната тръба. Не оставяйте животното без надзор по всяко време, докато не сте дошли в достатъчно съзнание за разходка и животното в клетката му.
  2. Администрирайте 2-3 ml стерилен затоплен разтвор на Рингер подкожно.
  3. Следете сърдечната честота (≈200 - 500 удара в минута), насищането с кислород (≥95%) и животинския цвят, за да потвърдите, че животното диша добре.
  4. Когато животното започне да прави спонтанни дихателни движения и движения на врата и реагира на физически стимули (като разширяване на очите, движение на носа и ушите в отговор на звука), екстубирайте животното, като издърпате тръбата и изключете вентилатора.
  5. Върнете животните в празна клетка, в компанията на други животни. Животното трябва да бъде само за поне 3 дни.
  6. За да контролирате болката, прилагайте бупренорфин 0,1 mg/kg подкожно на всеки 12 часа в продължение на 3 дни.

6. MCT или „Втора стачка“ или администрация на Sugen

  1. Прилагайте 1 ml MCT (60 mg/kg) или 1 ml Sugen (25 mg/kg) подкожно, една седмица след операцията.

7. терминал за прибиране на реколтата

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Според приетата система за класификация, белодробната хипертония се характеризира със средно налягане в белодробната артерия (MAPP), по-голямо от горните граници на нормалното налягане в белодробната артерия (т.е. 25 mm Hg). В групата с пневмонектомия + MCT, тежка БАХ се развива до ден 21 с по-висок РАРМ (Фигура 1). MPAP се изчислява по формулата:

Систоличното и диастоличното налягане, RV и PA, и са измерени с катетър за налягане в главната белодробна артерия, свързан към оловната фотоволтаична инсталация. Средното белодробно артериално налягане (РАРМ) се изчислява, използвайки горната формула. В контролната група (n = 20) средното налягане на BP е 18,6 ± 1,76 mm Hg (Фигура 1). В групата с пневмонектомия + MCT (n = 30) РАРМ се е увеличил 2,25 пъти повече в сравнение с контролната група (41,9 ± 2,89 mm Hg) (Фигура 1). В групата на Sugen + пневмонектомия (n = 30) PAPM е три пъти по-висока, отколкото в контролната група (53 ± 6.60 mm Hg). В MCT и Sugen групите RVSP е много по-висок в сравнение с контролната група (Фигура 1).

Хистопатологията на белодробната тъкан на плъхове се извършва с хематоксилин и еозин, последвано от изображения с оптичен светлинен микроскоп. В нормалния бял дроб има пространство между алвеолите и алвеоларните структури са очевидни. Съдовете са чисти и с нормална дебелина (Фигура 2А). В белия дроб PAH има данни за ремоделиране, удебеляване на стените на съдовете, силно свиване на съдовете и фокален белодробен артериит (Фигура 2В, ° С).


Фигура 1: тежка белодробна артериална хипертония при лява пневмонектомия, комбинирана с MCT модел. Значителни разлики в PAPM и RVSP между контролната група и MCT груповата пневмонектомия и контролната група и пневмонектомия + Sugen група. Данните са представени като средна SEM. P-стойностите бяха изчислени с помощта на еднопосочен ANOVA и Tukey post-hoc тест. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 2: Представителни микрофотографии на H&E оцветяване на белодробна тъкан. (ДА СЕ) Нормална белодробна тъкан. В нормалния бял дроб на плъховете артериите (червената стрелка) са отворени и стените на съдовете са с нормални размери. (Б.) Патологично съдово ремоделиране при плъхове от белодробна артериална хипертония, лекувани с пневмонектомия и MCT. Белият дроб показва фокален белодробен артериит и възпаление, концентрично медиално удебеляване на стените на съдовете (бяла стрелка) и концентрично интимно удебеляване на стените на съда (черна стрелка), което води до силно тесни съдове. (° С) Патологично съдово ремоделиране при плъхове PAH, лекувани с пневмонектомия и Sugen. Белите дробове също показват фокален белодробен артериит и възпаление, концентрично медиално удебеляване на стените на съдовете (бяла стрелка) и концентрично интимно удебеляване на стените на съдовете (черна стрелка). Лумените на тези съдове са силно ограничени или напълно затворени. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Както беше отбелязано по-горе, плъховете в други модели на ПАХ не развиват съдова облитерация на малки съдове, неоинтимални и плексиформни лезии и високо PA и RV налягане. Установено е, че лечението с PAH модел на хронична хипоксия води до удебеляване на съдовете, но съдовете остават отворени и няма облитерираща съдова лезия и малко възпаление 5. Стойностите на RVSP и mPAP са леко повишени в сравнение с контрола 5. По подобен начин лечението с MCT или пневмонектомия доведе до белодробно артериално налягане, което не беше значително по-високо от контролните плъхове и леко преустроени съдове 7, 9 .

За разлика от това бе установено, че лявата пневмонектомия, комбинирана с MCT или Sugen, е ефективен модел за създаване на тежка PAH. В сравнение с контролната група средното белодробно артериално налягане (PAPM) и систоличното налягане в дясната камера (RVSP) при плъхове с тежка PAH почти се удвоява (Фигура 1). В допълнение, тези плъхове развиват плексиформни лезии, концентрично медиално и интимно удебеляване, тромбоемболична обструкция на дисталните малки белодробни артерии и много високо белодробно артериално и дяснокамерно налягане (Фигура 2 ). Изправени пред хронична хипоксия, MCT инжектиране и PAH пневмонектомия само при други проучвания, пневмонектомия, комбинирана с MCT или Sugen модел, създава клинично значимо състояние. В допълнение, този модел, ако се извърши правилно, има близо 0% интраоперативна смъртност и само 10% смъртност след възстановяване от липсата на десния бял дроб, за да компенсира дихателната недостатъчност. По-високите нива на смъртност интраоперативно или след възстановяване обикновено са показателни за грешка при хора или оборудване.

За успешното извършване на лява пневмонектомия и създаване на ПАХ има няколко критични стъпки в този протокол, които трябва да бъдат завършени. Първо, много е важно да се наблюдава насищането на животното с кислород, капнографията и броенето на сърдечната честота през цялата процедура, за да се гарантира, че животното диша и сърцето му бие. Мониторингът на насищане с кислород допълнително потвърждава правилната интубация. Интубацията на животното е абсолютно необходима за тази процедура. Когато гръдната кухина на животното се отвори, отрицателното налягане, което обикновено съществува в гръдната кухина, преминава към положително атмосферно налягане. По този начин плъховете се нуждаят от положително налягане чрез изкуствена вентилация. Без подходяща интубация белите дробове на животното ще се срутят от положителното атмосферно налягане.

И накрая, възстановяването е една от най-критичните стъпки след пневмонектомия на плъхове. Торакотомията е много болезнена операция и аналгетиците са от съществено значение за насърчаване на адекватна вентилация, подобряване на белодробните екскурзии в следоперативния период и намаляване на болката. Плъховете трябва да се възстановят в позиция на стернал, за да увеличат максимално белодробната инфлация. След 10 минути изследователят може да намали скоростта на вентилация, за да стимулира животното да диша самостоятелно и да се събуди. Ако животното стане цианотично и нивата на насищане с кислород намаляват, е необходимо да се увеличи кислородът, скоростта на вентилация и да се увеличи обемът до 5 ml или повече в зависимост от капацитета на вентилатора. Екстубацията на плъхове трябва да се извършва възможно най-късно, след като животното е напълно будно. Изследователят може да постави екстубирания плъх в камера с поток на кислород, което помага за по-голямото възстановяване.

Ако техниката се изпълнява правилно и горните съображения са адресирани, извършването на комбинирана лява едностранна пневмонектомия с MCT или Sugen създава надежден модел на тежка PAH, отколкото само хипоксия, MCT или други методи. Пневмонектомията се извършва правилно, животното оцелява, процедурата е кратка (15-30 минути) и изследователят не се нуждае от специфични съдови хирургически умения. В допълнение, изследователят е в състояние успешно да създаде PAH. Ограниченията на този метод са, че торакотомията е инвазивна процедура, необходима е ендотрахеална интубация и изследователят се нуждае от някои общи хирургически умения. Неоинтимални белодробни съдови оклузивни лезии и изразено повишаване на налягането в белодробната артерия, подобно на пациентите с белодробна хипертония при човека, са очевидни при плъхове след комбинацията от пневмонектомия с MCT или SU5416 инжекция 7, 8, 9. настоящият модел е надежден метод за изследване на ролята на белодробното преливане в контралатералния бял дроб и индуцираната от потока белодробна хипертония.

Този протокол може да бъде полезен за изследване на други заболявания. Този модел може да се използва за изследване на компенсаторния растеж на белодробната тъкан в контралатералния бял дроб. Тази техника може да се използва и за изследване и разработване на лечения за дяснокамерна недостатъчност (RVF). Силна хипертрофия на дясната камера се развива при животни, които развиват неоинтимални лезии с повишено кръвно налягане 7. RVF причинява смърт при приблизително 70% от пациентите с БАХ 13. Увеличаването на белодробния кръвен поток може да бъде полезно за проучване и разработване на лечения и за пациенти, страдащи от вродени сърдечни заболявания.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите нямат потенциален конфликт на интереси.