двуденалната

Esther Nistal1, Jenifer Pérez-Andrés1, Alexandra R Herrán1, Alberto Caminero4, Santiago Vivas3, José M Ruiz de Morales2, Ricardo Vicente Ullan6 и Javier Casqueiro 1,

Зона за микробиология, Факултет по биологични и екологични науки, Университет в Леон. Отделение за 2 имунология и 3 гастроентерология, болница Леон. 4 Институт по молекулярна, геномна и протеомна биология (INBIOMIC) и Институт по биомедицина (IBIOMED) Campus de Vegazana, Университет в Леон. 6 Институт по биотехнологии в Леон. Лъв.

РЕЗЮМЕ

Глутенът, много често срещан компонент в човешката диета, е способен да активира патогенезата на целиакия при генетично предразположени индивиди. Въпреки че ролята на човешките храносмилателни ензими върху глутеновите протеини е много добре известна, има голяма липса на знания за ролята на чревната микробиота в нейния метаболизъм. Целта на това проучване беше да се анализира молекулярно дуоденалната микробиота, която участва в метаболизма на глутена, използвайки PCR-DGGE. За това дуоденалните биопсии на деца и възрастни се култивират в хранителна среда (MCB), която съдържа глутен като единствен източник на азот.

Анализът чрез PCR-DGGE показа, че дуоденалната микробиота, способна да расте в MCB, е доминирана от Streptococcus salivarius и S. oralis. Въпреки това бяха открити и други родове като Lactobacillus, Gemella, Haemophilus, Clostridium, Granulicatella и Staphylococcus, макар и с по-ниска честота. Следователно, въпреки че няма електрофоретичен профил, който може да бъде свързан със заболяването, се наблюдава голямо разнообразие от дуоденални бактерии, които могат да участват в метаболизма на глутена. Необходими са повече проучвания за подробна характеристика на дуоденалната микробиота, свързана с метаболизма на глутена, за да се разгледат възможните терапевтични алтернативи в бъдеще.

ВЪВЕДЕНИЕ

Целиакията (CD) е хронично възпалително заболяване на червата, което се проявява при генетично чувствителни индивиди и се причинява от неподходящ имунен отговор на глутенови протеини (1, 2). Понастоящем единственото ефективно лечение на CD е пълното елиминиране на глутена от диетата през целия живот на пациента (3) .

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Пациенти и проби от дванадесетопръстника

Културна среда и културни условия

За изолирането на микроорганизмите от биопсичната култура се използва течната среда MCB, проектирана в нашата лаборатория, която съдържа глутен като единствен източник на азот: 2mM CaCl2, 2mM ZnSO4, 2% глюкоза, 0,1% Tween 80 (v/v ), 20 цМ FeCI3, глутен (Sigma-Aldrich) 3% и глутен, усвоен с 0,5% пепсин. РН се регулира до 6.5 с фосфатен буфер (1%). Средата беше стерилизирана в автоклава в продължение на 20 минути при 121 ° С. Впоследствие, чрез нанасяне на покритие, беше проверено, че средата е напълно стерилна.

3% глутеновият смилаж (100 mL) се получава чрез инкубиране на 3 g глутен с 1 g пепсин при рН 2, коригирано с HCl (10М). Сместа се инкубира в продължение на 2 часа при 37 ° С с разклащане (250 rpm). След това рН се повишава до 6,5 с NaOH (1М) и впоследствие се стерилизира при 121 ° С в автоклава за 20 минути.

Биопсията се инокулира в колба с 10 ml хранителна среда и се инкубира в продължение на 48 часа при 37 ° С с разклащане (100 rpm) при микроксични условия.

Извличане на ДНК от култури
биопсия и PCR амплификация

Извличането на геномна ДНК от биопсични култури се извършва в съответствие с инструкциите на протокола за екстракция на ДНК на SpeedTools Tissue DNA (Biotools, Spain). Концентрацията на ДНК се определя с помощта на спектрофотометъра NanoDrop ND-1000 (Saveen & Werner, Limhann, Швеция).

За да се характеризира молекулярно дуоденалната микробиота, две променливи области с различен размер на 16S рибозомната ДНК се усилват чрез PCR, за да се сравнят получените резултати с двата фрагмента. За амплифицирането на 16S рРНК гените бяха използвани две двойки праймери. двойката олигонуклеотиди HDA1GC и HDA2 (16), които усилват фрагмент от около 200 bp, съответстващ на V3 областта на 16S rDNA и двойката праймери F968GC и R1401 (17), които усилват фрагмент от приблизително 450 bp от V6- регион 16S рДНК V8. За тези усилвания е използван търговският комплект iProof High-Fidelity Master Mix (BioRad). PCR програмата, която беше използвана за този комплект, се състоеше от първоначална денатурация от 98 ° C за 30 секунди и оттук нататък 30 цикъла със следните температури: 98 ° C за 10 секунди, 56 ° C или 55 ° C за 30 секунди и 72 ° C, 30 секунди. Програмата за PCR завършва с удължаване при 72 ° C за 10 минути.

Анализ на микробиотата, получена от културата на дуоденални биопсии чрез денатурираща градиентна електрофореза (DGGE)

Разликите в броя на видовете между различните групи популации бяха анализирани с помощта на теста "хи-квадрат" (приложена корекция на Йейтс). Установена е статистическа значимост за р стойности

РЕЗУЛТАТИ

Молекулярен анализ чрез PCR-DGGE
от V3 региона на 16S рДНК

Фигура 1 показва профилите DGGE, получени от PCR продуктите на V3 региона, като се използва ДНК на дуоденалните биопсични култури като шаблон. Различните профили показват между 1 до 5 интензивни и добре разрешени ленти. Останалите ленти бяха слаби или подобни на петна. Не се наблюдават статистически значими разлики по отношение на броя на лентите между електрофоретичните профили на здрави индивиди и тези на пациенти с целиакия, както активни, така и лекувани, нито разлики, свързани с възрастта.

Няколко ленти бяха избрани за извършване на тяхната молекулярна идентификация. PCR продуктите, които бяха идентифицирани чрез секвениране от лентите DGGE, са показани в таблица I. За да завърши молекулярната идентификация на всяка от секвенираните ивици, беше извършен филогенетичен анализ. Честотата на различните видове, открити чрез PCR-DGGE, е показана в таблица II. В рамките на различните идентифицирани видове преобладават Streptococcus salivarius и S. oralis, които са открити на практика при всички индивиди, както деца, така и възрастни, независимо от заболяването. За разлика от тях, Bacillus cereus, Haemophilus influenza, Lactobacillus mucosae и Staphylococcus epidermidis са открити само от биопсии на култури при деца, но с много ниска честота. От културата на биопсии от възрастни индивиди, видове като Clostridium perfringens, Granulicatella elegans или G. adiacens, Lactobacillus crispatus и L. gasseri също се появяват с ниска честота. .

Молекулярен анализ чрез PCR-DGGE на V6-V8 региона на 16S рДНК

PCR продуктите, генерирани от праймерите F968GC/R1401, се разделят с DGGE върху 8% акриламид/бисакриламидни гелове в денатуриращ градиент от 40-60% урея и формамид. Както може да се види на фигура 2, моделите на DGGE ленти, получени с универсалните праймери, съответстващи на V6-V8 областта на 16S rDNA, показват много малко ленти (между 1 до 4 ленти), но по-голямата част са добре решени. Нито един електрофоретичен профил не може да бъде свързан със заболяването. Не се наблюдават и разлики по отношение на броя на лентите, присъстващи в електрофоретичните профили на деца и възрастни, или между здрави и болни.

От геловете бяха избрани няколко ленти за извършване на тяхната молекулярна идентификация. PCR продуктите, които бяха идентифицирани чрез секвениране от лентите DGGE, са показани в таблица III. Честотата на всяка от тези ленти е показана в таблица IV. Резултатите са подобни на тези, получени с праймерите, които усилват региона V3, тъй като идентифицираните видове са еднакви, с появата на някои нови. Отново амплифицираните фрагменти, съответстващи на видовете Streptococcus oralis и S. salivarius, се появяват на практика при всички здрави и болни индивиди, независимо от възрастта. Напротив, Granulicatella elegans или G. adiacens е открит при 4 от 6-те деца RCT и не се появява при нито едно от здравите деца. Останалите идентифицирани видове са с много ниска честота, тъй като се появяват само в една или две от анализираните биопсии (Таблица IV).

Фигура 1.- DGGE профили на бактериални съобщества, получени от култура в съдържаща глутен среда на биопсии от деца без целиакия (Non-ECN) (платна 1 и 2), деца с целиакия (ECAN) (линии от 3 до 8), нецелиакия възрастни (извън ECA) (платна 9 до 16), възрастни с активна целиакия (ECAA) (платна 17 до 19) и лекувани възрастни от целиакия (ECTA) (платна 20 до 24). Праймерите, използвани за осъществяване на PCR реакцията, са HDA1GC/HDA2. Цифрите показват секвенираните фрагменти, чиято идентификация е показана в Таблица I

Фигура 2.- DGGE профили на бактериални общности, получени от биопсична култура в безглутенова среда на неболни деца
целиакия (Non-NEC) (платна 1 и 2), деца с активна целиакия (ECAN) (платна 3 до 8), възрастни без целиакия (No-RCT)
(платна 9 до 16), възрастни с активна целиакия (ECAA) (платна 17 до 19) и лекувани възрастни целиакия (ECTA) (платна на
20 до 24). Праймерите, използвани за провеждане на PCR реакцията, са F968GC/R1401. Цифрите означават фрагменти, секвенирани,
чиято идентификация е показана в таблица III

ДИСКУСИЯ

Други родове като Lactobacillus, Gemella, Haemophilus, Clostridium, Granulicatella и Staphylococcus също се откриват чрез PCR-DGGE, макар и с по-ниска честота. Това, което характеризира всички тези микроорганизми, е, че те са способни да растат в хранителна среда, която съдържа глутен като единствен източник на азот. Това може да се обясни по различни причини; i) имат протеолитична активност срещу глутен; ii) напротив, липсва им тази активност, но те са способни да растат в тази среда благодарение на хранителните вещества, осигурени от други микроорганизми, които са способни да хидролизират глутена; iii) или растежът им е благоприятен, тъй като те са в състояние да използват по-малките пептиди, които произхождат в резултат на частичното усвояване на глутена с пепсин. Предишни проучвания показват, че различни бактериални щамове от родове като Clostridium, Lactobacillus и Staphylococcus са способни да хидролизират глутена (11). Следователно тези микроорганизми могат да имат роля в метаболизма на глутена в дванадесетопръстника.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа е финансирана по проект на здравния институт Карлос III, Фонд за здравни изследвания, съфинансиран от FEDER (FIS P110/02447) и по проект на Junta de Castilla y León, Министерство на здравеопазването (Реф. 520/A/10). Естер Нистал и Александра Родригес получиха грант от Junta de Castilla y León, съфинансиран от Европейския социален фонд. Дженифър Перес-Андрес получи стипендия от Министерството на образованието, културата и спорта на правителството на Испания

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Ludvigsson JF, Leffler DA, Bai JC, Biagi F, Fasano A, Green PHR, et al. Определенията в Осло за цьолиакия и свързани термини. Gut 2012; 62 (1): 43-52.

2. Hill ID, Dirks MH, Liptak GS, Colletti RB, Fasano A, Guandalini S, et al. Насоки за диагностика и лечение на целиакия при деца: препоръки на Северноамериканското общество за детска гастроентерология, хепатология и хранене. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005; 40 (1): 1-19.

3. Ciclitira PJ, Johnson MW, Dewar DH, Ellis HJ. Патогенезата на цьолиакия. Mol Aspects Med 2005; 26: 421-58.

4. Shan L, Molberg Ø, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, et al. Структурна основа за непоносимост към глутен в целиакия. Наука 2002; 297: 2275-9.

5. Caminero A, Nistal E, Arias L, Vivas S, Comino I, Real A, et al. Изследване на метаболизма на глутена при здрави индивиди показва наличието на фекална глутеназна активност. Eur J Nutr, 2012; 51 (3): 293-9.

6. Helmerhorst EJ, Zamakhchari M, Schuppan D, Oppenheim FG. Откриване на нов и богат източник на разграждащи глутена микробни ензими в устната кухина. PLoS One 2010; 5 (10): e13264.

7. Zamakhchari M, Wei G, Dewhirst F, Lee J, Schuppan D, Oppenheim FG, et al. Идентифициране на бактериите Rothia като разграждащи глутена естествени колонизатори на горния стомашно-чревен тракт. PLoS One 2011; 6 (9): e24455.

8. Nistal E, Caminero A, Herrán AR, Arias L, Vivas S, de Morales JM et al. Разлики в популациите на тънките чревни бактерии при възрастни и деца с/без целиакия: ефект на възрастта, глутенова диета и заболяване. Dislamm Bowel Dis 2012; 18 (4): 649-56.

9. Laparra JM, Sanz Y. Бифидобактериите инхибират възпалителния отговор, индуциран от глиадини в чревните епителни клетки чрез модификации на генерирането на токсичен пептид по време на храносмилането. J Cell Biochem 2010; 109 (4): 801-7.

10. Sánchez E, Laparra JM, Sanz Y. Разбиране на ролята на Bacteroides fragilis в патогенезата на целиакия. Appl Environment Microbiol 2012; 78 (18): 6507-15.

11. Caminero A, Herrán AR, Nistal E, Pérez-Andrés J, Vaquero L, Vivas S, et al. Разнообразие от микробиома на човешките черва, участващ в метаболизма на глутена: изолиране на микроорганизми с потенциален интерес за цьолиакия. FEMS Microbiol Ecol 2014; 88: 309-19.

12. Forsberg G, Fahlgren A, Horstedt P, Hammarstrom S, Hernell O, Hammarstrom ML. Наличие на бактерии и вроден имунитет на чревния епител при детска целиакия. Am J Gastroenterol 2004; 99: 894-904.

13. Collado MC, Calabuig M, Sanz Y. Разлики между фекалната микробиота на целиакия и здравите контроли. Curr Issues Intest Microbiol 2007; 8: 9-14.

14. Nadal I, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Дисбаланс в състава на дуоденалната микробиота при деца с цьолиакия. J Med Microbiol 2007; 56: 1669-74.

15. Sanz Y, Nadal I, Sánchez E. Пробиотиците като лекарства срещу стомашно-чревни инфекции при човека. Скорошно антиинфекционно лекарство за откриване на Pat 2007; 2: 148-56.

16. Уолтър. J, Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S, Loach DM, Munro K, et al. Откриване и идентифициране на стомашно-чревни видове Lactobacillus чрез използване на денатурираща градиентна гел електрофореза и специфични за вида PCR праймери. Appl Environ Microbiol 2000; 66: 297-303.

17. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Oyaizu H. Бърза идентификация на човешките чревни бифидобактерии чрез 16S rRNA-насочени видови и групови специфични праймери. FEMS Microbiol Lett 1998; 167: 113-21.

18. Sullivan A, Tornblom H, Lindberg G, Hammarlund B, Palmgren AC, Einarsson C, et al. Микрофлората на тънките черва в здраве и болести. Анаероб 2003; 9: 11-4.

19. Zilberstein B, Quintanilha AG, Santos MA, Pajecki D, Moura EG, Alves PR, et al. Микробиота на храносмилателния тракт при здрави доброволци. Клиники (Сао Пауло) 2007; 62: 47-54.

20. Fernandez-Feo M, Wei G, Blumenkranz G, Dewhirst FE, Schuppan D, Oppenheim FG, et al. Културният човешки микробиом за разграждане на глутена през устата и неговите потенциални последици при цьолиакия и чувствителността към глутен. Clin Microbiol Infect 2013; 19: E386-94.

21. Tian N, Wei G, Schuppan D, Helmerhorst EJ. Ефект на ензимите Rothia mucilaginosa върху структурата на глиадин (глутен), дезаминирането и имуногенните епитопи, свързани с цьолиакия. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2014; 307: G769-76.

22. Laparra JM, Olivares M, Gallina O, Sanz Y. Bifidobacterium longum CECT 7347 модулира имунните реакции в индуциран от глиадин ентеропатичен животински модел. PloS One 2012; 7: e30744.

23. Cosseau C, Devine DA, Dullaghan E, Gardy JL, Chikatamarla A, Gellatly S, et al. Коменсалният Streptococcus salivarius K12 понижава регулирането на вродените имунни реакции на човешките епителни клетки и насърчава хомеостазата на гостоприемника и микроба. Infect Immun 2008; 76: 4163-75.

24. Sliepen I, Van Damme J, Van Essche M, Loozen G, Quiryne M, Teughels W. Микробните взаимодействия влияят върху възпалителните отговори на клетките гостоприемници. J Dent Res 2009; 88: 1026-30.

25. Sanz Y, Sánchez E, Marzotto M, Calabuig M, Torriani S, Dellaglio F. Различия във фекалните бактериални съобщества при целиакия и здрави деца, установени чрез PCR и денатурираща градиентна гел електрофореза. FEMS Immunol Med Microbio 2007; 51: 562-8.

26. Collado MC, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. Специфични дуоденални и фекални бактериални групи, свързани с детска целиакия. J Clin Pathol 2009; 62: 264-9.

27. Bernardo D, Garrote JA, Nadal I, León AJ, Calvo C, Fernández-Salazar L, et al. Вярно ли е, че целиаките не усвояват глиадин? Модел на разграждане на глиадин при целиакия на лигавицата на тънките черва. Gut 2009; 58: 886-7.

28. Arumugam M, Raes J, Pelletier E, Le Paslier D, Yamada T, Mende DR, et al. Ентеротипове на човешкия чревен микробиом. Природа 2011; 473: 174-80.

29. Cocolin L, Manzano M, Cantoni C, Comi G. Денатуриращ градиентен анализ на гел електрофореза на 16S рРНК ген V1 регион за проследяване на динамични промени в бактериалната популация по време на ферментацията на италиански колбаси. Appl Environ Microbiol 2001; 67: 5113-21.

30. Van Beek S, Priest FG. Еволюция на млечнокиселата бактериална общност по време на ферментация на малцово уиски: многофазно проучване. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 297-305.

31. Yun JH, Yim DS, Kang JY, Kang BY, Shin EA, Chung MJ, et al. Идентифициране на Lactobacillus ruminus SPM0211, изолиран от здрави корейци и неговата антимикробна активност срещу някои патогени. Arch Pharm Res 2008; 28: 660-6

32. Sainsus N, Cattori V, Lepadatu C, Hofmann-Lehmann R. Течна хранителна среда за бързо култивиране на Helicobacter pylori от биопсични проби. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27: 1209-17.