Кратко описание

1 ОТДЕЛ ЗА ФИЗИОЛОГИЯ МУСКУЛНИ И ХЕМАТОЛОГИЧНИ ЕФЕКТИ ОТ УПОТРЕБАТА на rhuepo В КОМБИНАЦИЯ С УНГ.

безплатно

Описание

ОТДЕЛ ЗА ФИЗИОЛОГИЯ

МУСКУЛНИ И ХЕМАТОЛОГИЧНИ ЕФЕКТИ ОТ УПОТРЕБАТА на rHuEpo В КОМБИНАЦИЯ С ФИЗИЧЕСКО ОБУЧЕНИЕ. ВЪЗДЕЙСТВИЯ НА ДЕМОСПРЕЗИН И ХИПОКСИЯ ПРИ КРЪВЕН ДОПИНГ. ИЗСЛЕДВАНИЯ IN VIVO И IN VITRO.

ВЛАДИМИР ЕСАУ МАРТОНЕЗ БЕЛО

UNIVERSITAT DE VALÈNCIA Publications Service 2011

Докторската дисертация на Aquesta ще бъде представена във Валенсия на 5 май 2011 г., като ще бъде представен съдебен формат за: -

Д-р Хуан Састре Беллок Д-р Илва Хелстен Д-р Хосе Антонио Лопес Калбет Д-р Хосеп Антони Тур Мари Д-р Консуело Бораш Бласко

Режисьор ще бъде: д-р Хосе Виня Рибес д-р Федерико В. Палардо Калатаюд д-р Mª Кармен Гомес Кабрера

Legal Dipòsit: V-478-2012 I.S.B.N.: 978-84-370-8203-5 Публикувано от: Universitat de València Servei de Publicacions C/Arts Gràfiques, 13 baix 46010 València Испания Телефон: (0034) 963864115

Факултет по медицина и стоматология Катедра по физиология

МУСКУЛНИ И ХЕМАТОЛОГИЧНИ ЕФЕКТИ ОТ УПОТРЕБАТА на rHuEpo В КОМБИНАЦИЯ С ФИЗИЧЕСКО ОБУЧЕНИЕ. ОТРАЖЕНИЯ НА ДЕЗМОПРЕСИН И ХИПОКСИЯ ПРИ КРЪВЕН ДОПИНГ. ИЗСЛЕДВАНИЯ IN VIVO И IN VITRO. ДОКТОРСКА ТЕЗА Представено от: Владимир Есау Мартинес Бело Режисьор: проф. Д. Хосе Виня Рибес проф. Д. Федерико Палардо Калатаюд проф. Г-жа Мари Кармен Гомес Кабрера Валенсия, 2011 г.

Тази докторска дисертация е осъществена благодарение на финансирането, получено от следните проекти:

• Министерство на науката и иновациите (BFU2007-65 803/BFI) • Висш спортен съвет (24/UPB20/07 и 35/UPB20/08) •

Здравен институт Карлос III (ISCIII2006-RED13-027)

• Помощ за обучението на програма за докторантски изследователски персонал "V Segles" Modalitat V Segles - компания. Университет във Валенсия. .

Проф. Д. Хосе Виня Рибес, професор от Катедрата по физиология на Медицинския и стоматологичен факултет на Университета във Валенсия. Проф. Д. Федерико Палардо Калатаюд, професор от Катедрата по физиология на Медицинския и стоматологичен факултет на Университета във Валенсия. Проф. Д-р Мари Кармен Гомес Кабрера, професор в Медицинския и стоматологичен факултет на Университета във Валенсия. УДОСТОВЕРЕНИЕ: че г-н Владимир Есау Мартинес Бело, професионалист по физическа култура, спорт и отдих от Университета Санто Томас, Букараманга (заглавие, одобрено от MEC на това на бакалавър по физическа активност и спорт), е извършил под негово ръководство настоящата теза, озаглавена: МУСКУЛНИ И ХЕМАТОЛОГИЧНИ ЕФЕКТИ ОТ УПОТРЕБАТА на rHuEpo В КОМБИНАЦИЯ С ФИЗИЧЕСКО ОБУЧЕНИЕ. ОТРАЖЕНИЯ НА ДЕЗМОПРЕСИН И ХИПОКСИЯ ПРИ КРЪВЕН ДОПИНГ. ИЗСЛЕДВАНИЯ IN VIVO И IN VITRO.

за да получи титлата доктор.

И за протокола за подходящите цели, те подписват това удостоверение. Валенсия, 10 януари 2011 г.

Подписано. Проф. Д. Хосе Виня Рибес

Подписано. Федерико Палардо Калатаюд

Подписано. Проф. Г-жа Мари Кармен Гомес Кабрера

НА МОИТЕ РОДИТЕЛИ, ЖОСЕ МАРА И МАРА ЗОРАЙДА

ПРИЗНАВАНИЯ "Не ме наричайте чужденец или мислете откъде идвам, по-добре да знаем къде отиваме, къде ни отвежда времето." Алберто Кортес.

Винаги съм вярвал, че признателността е най-важната част от дипломната работа. И това не е изключение. В това се материализира, че резултатът не е плод само на моята работа, но и на малкия голям принос на всички, които споделиха с мен тези пет години. Никога през цялото това време хората и коридорите на Физиологичния отдел не ме караха да се чувствам чужд, за това благодаря на всички. По-специално искам да благодаря на директорите на тази дисертация, д-р Хосе Виня, д-р Федерико Палардо и д-р Мари Кармен Гомес, че са ръководили и съпътствали този процес на обучение. На д-р Виня, благодаря ви, че ми дадохте възможност да бъда част от сериозен екип, отдаден на търсенето на истината. Яснотата на хипотезите и тази на „какъв въпрос задавам днес на природата“ е красив и правилен начин да се научи да се изследва.

На д-р Палардо, че съм внимателен към сътрудничеството с финансирането и административните процедури на моята стипендия. Подкрепата във всички фази на дипломната работа е непобедима. и

казвате, когато светът започне да свършва, ние ще се върнем. На Олга и Сарита, силна целувка. За Татис, малката ми сестра, ние изживяхме различни, но значителни преживявания. От втората година вие сте близката подкрепа на семейството. Животът ни се подобри през последните години, сега всичко е различно и това е триумф, всичко се подобрява. Обичам те Татис и ето ни и сме на прав път. За Раул мисля да подобря коледните подаръци, но не ви уверявам много. Прегръдка. И искам да благодаря със сърцето си в ръка на двама много важни хора в живота ми: моят Папи Хосе Мария и моята Мами Мария Зорайда. Вие сте били архитектите на сбъдването на тази мечта, мечтата да станете доктор. Тази мечта е възможна благодарение на дисциплина, навик, отдаденост, отговорност и непрекъснато търсене на обич, за да правя винаги това, което се иска и това, което харесвам, но преди всичко като съм създал и структурирал в мен един житейски проект. Днес е най-важният ден в живота ми и вие двамата сами, както когато започнахте от нулата, го направихте. Обичам те, прегръдка чупи кости и ние се обичаме.

ОБЩИ ИНДЕКСИ I. Въведение ……………………………. 1-86 1. Физиологичната роля на еритропоетина ………… 1-10 1.1 Генът на еритропоетина …………………………… .1 1. 2. Роля на Epo в не-еритроидни клетки ... ……… . 4 1.3. Биологични действия на Епо в скелетната мускулатура …………………………………………. 5 1.4. Прилагане на рекомбинантен еритропоетин (rHuEpo) и увеличаване на капацитета за транспортиране на кислород …………………………………………… .7 1.5. Лечение с rHuEpo, повишаване на хематокрита и вискозитета на кръвта .................. 8 2. Регулиране на митохондриалната биогенеза в скелетните мускули …………………………… 11-20 2.1 PGC -1α: Коактиватор 1α на рецептора γ, активиран от пролиферация на пероксизома ……… . ……………… .12 2.2 PGC-1α и неговата роля в регулирането на антиоксидантната защита …………………… ……… ……………… 13 2.3 Ядрен дихателен фактор 1 (NRF-1) ……………… 16 2.4 Митохондриален транскрипционен фактор А. Експресия на митохондриална ДНК ……………………………… .... 17 2.5 Цитохром С …………………………………………… 19

3. Миогенни регулаторни фактори ……………. 20-21 4. Хипоксия ……………………………………………. 22-42 4.1 Определение ………………………………………………… 22 4.2 Индуцируем от хипоксия фактор: HIF-1 ………………… .23 4.2.1 Гени, регулирани в отговор на намаляването на наличния кислород …………………………… .25 4.2.2 Пируват дехидрогеназа киназа 1 (PDK-1)… 27 4.3 PGC-1α и HIF-1α ………………………………… .28 4.4 Хипоксия и физически упражнения …………………………… . 29 4.4.1 Хипоксия и хематологични адаптации при гризачи ………………………………………… 29 4.4.2 Използване на височинни системи в спорта. Хипоксия, насочена към подобряване на физическата работоспособност …………………………………………… .30 5. Използване на вещества и методи, забранени от Световната антидопингова агенция (WADA) ………. 43-55 5.1 Списъкът на веществата и методите, забранени в спорта ………………………………………………… 43 5.2 Световната антидопингова система и борбата срещу допинга на кръв ………… ………………………… .44 5.2.1 Пряки и косвени методи за откриване на допинг на кръв ……………………………… 45 5.2.2 Биологичният паспорт ……………… ………… .48 5.2.3 Плазмени разширители за обем ………… .51 5.2.4La

6. Свободни радикали ……………………………………… .56-70 6.1 Понятие за свободните радикали …………………………… .56 6.2 Класове свободни радикали ………… ………………… 57 6.3 Произход на ROS …………………………………. 58 6.3.1 Екзогенни източници ………………………………. 59 6.3.2 Ендогенни източници. 60 6.3.2.1

митохондриални ………………………………. 60 6.3.2.2 Реакция на Фентън-Хабер-Вайс ………… 64 6.4 Оксидативен стрес. ………………………. 66 6.4.1 Понятие за оксидативен стрес …………………… .66 6.4.2 Оксидативен стрес и увреждане на биомолекулите ………. 66 6.4.2.1 Окислително увреждане на липидите ……………………… 67 6.4.2.2 Окислително увреждане на протеините …………………. 69 6.4.2.3 Окислително увреждане на ДНК ……………………… .70 7. Антиоксиданти ……………………………………… . 71-86 7.1 Понятие за антиоксидант ……… ………………… .71 7.2 Ензимни антиоксиданти ………………………… .72 7.2.1 Супероксиддисмутаза ………………………… .72 7.2.2 Глутатион пероксидаза …… ……………………… .73 7.2.3 Каталаза ………………………………………… .74 7.3 Хипоксия и оксидативен стрес …………………………. .75 7.3.1

увеличаване на производството на свободни радикали във връзка с хипоксия ………………………………… .76 7.3.1.1 Физически упражнения. 76

7.3.1.2 Ултравиолетови лъчи ………… . ……………… .76 7.3.1.3 Липса на антиоксидантна диета …………… .77 7.3.1.4 Ендогенни източници на радикално производство

хипоксия ……………………………………… 77 7.3.1.4.1 Митохондрии ……………………………. 77 7.3.1.4.2 Исхемия - явление на реперфузия ... 78 7.3.1.4.3 Ксантинова оксидаза ………………………. 79 7.4 Ефект от излагането на хипоксия върху различни маркери на окислително увреждане ................ 80 7.4.1 Проучвания върху животни ............................... 7.4.2 Проучвания при хора ……………………… .82

II. Цели…. 87-88 III. Материали и методи. ……… .89-135 1. Материали …………………………… .89-114 1.1. Проучвания върху експериментални животни ....... 90 1.1.1. Изследване на ефекта от лечението с rHuEpo върху различни мускулни и хематологични адаптации при опитни животни ……………………… .90 1.1.1.1 Опитни животни ………… .90 1.1.1.2

лечение с rHuEpo ……… 90 1.1.1.3

кръв и тъкани ……………… .91

1.1.2 Проучване на ефекта от протокол за хипоксия

мускулни и физически показатели при опитни животни ……………………………… 92 1.1.2.1 Опитни животни ……………. 92 1.1.2.2 Протокол

нормобарен ………………………………… .93 1.1.2.3 Проучване върху ефекта от анаеробното обучение

аеробика. 93 1.1.2.4 Екстракция

тъкани ………………………………………… 94 1.1.2.5 Клане на животни ………………… .95 1.1.3 Проучване на ефекта от две лечения с rHuEpo и нормобарик протокол за интермитентна хипоксия,

експерименти ……………………………… .96 1.1.3.1 Експериментални животни. 96 1.1.3.2 Протокол

нормобарични и rHuEpo лечения. 96 1.1.4 Изследване на ефекта от протокола за хипоксия

хематологични параметри след

приложение на rHuEpo при опитни животни ………………………………… 97 1.1.4.1 Експериментални животни …………… 97 1.1.4.2 Протокол за лечение

Кръвни проби ……………………. 99

Клане на животни ……………. 101

1.2 Проучване при хора. 101 1.2.1 Изследване на ефекта от лечението с десмопресин

допинг на кръв …………………………… .101 1.2.1.1 Хора…. 101 1.2.1.2 Експериментален дизайн ……………………… .102 1.3 Проучване in vitro. Роля на реактивните кислородни видове и PGC-1α в регулирането чрез свиване на индукцията на MnSOD в скелетните мускули на мишка …………………………………………… .104 1.3.1 Мишки …………… …………………………… .104 1.3.2 Изолиране и първична култура на мускулни клетки на мишки. 105 1.3.3

Протокол за електрическа стимулация ... 106

Протокол за остра електростимулация в присъствието или отсъствието на антиоксиданти ... .106

Повторен протокол за електростимулация в присъствието или отсъствието на антиоксиданти ... .107

2. Методи. 114-135 2.1 Протокол за определяне на максималния аеробен капацитет при плъхове …………………. ………………… .114 2.2 Определяне на еритропоетина …………………… .115 2.2.1 Обосновка… …………………………………… .115 2.2.2 Подготовка на пробата ……………………… .116 2.2.3 Процедури и изчисления ………………………. .116 2.3 Определяне на хемоглобина, хематокрита и% ретикулоцити …………………………………………… .117 2.4 Определяне

еритроцит. 117 2.5 Определяне на креатинин, албумин, общ протеин и глюкоза ……………………………………… 118 2.6 Екстракция на протеини от мускулната тъкан 118 2.6.1 Обосновка ………………… ……… …………… .118 2.6.2 Протокол ………………………………………. 119 2.6.3 Количествено определяне ……………………………………… 120 2.7 Метод

протеини: Метод на Lowry ………………………… 120 2.7.1 Обосновка …………………………………… .120 2.7.2 Реагенти …………………… …… ………………. 121 2.7.3 Процедура ……………………………………. 121

2.7.4 Изчисления …………………………………………… .121 2.8 Електрофореза

(PAGE-SDS) и последващо Western Blotting ………… 122 2.8.1 Обосновка ……………………………………… .122 2.8.2 Гел и условия за трансфер ……………. 123 2.8.3 Визуализация ……………………………………… .124 2.9 Определяне на активността на цитрат синтазата (EC 2.3.3.1). 126 2.9.1 Реагенти …………………………………………. 126 2.9.2 Процедура на хомогенизиране ............... 127 2.9.3 Измерване на активността ………………………… .127 2.9.4 Изчисления …………………………………………… .128 2.10 Изолиране на РНК от скелетния мускул на мишката клетки ……………………………… .128 2.10.1 Процедура ……………………………………………. 129 2.10.2 Количествено определяне на концентрацията на РНК …… .129 2.10.3 Синтез на кДНК: Ретротранскрипция (RT) …… .130 2.10.4 Количествено усилване на РНК (RT-PCR в реално време) ……………… …………… …………… 131 2.11 Извънклетъчно определяне на реактивни кислородни видове

IV. Резултати… . …………………… .136-187 1. Проучване на ефекта от лечението с rHuEpo, в продължение на две седмици, в различни

експерименти ... 136-149 1.1 Хематологични адаптации при опитни животни ………………………………… 137 1.2 Експресия на протеини, свързани с митохондриалната биогенеза в скелетната мускулатура на плъхове ……………………………… ……… …… .141 1.2.1 Ефект от лечение с rHuEpo в продължение на две седмици върху експресията на PGC-1α, NRF1 и mTFA в мускула на плъховата мишка ………… 142 1.2.2 Ефект от лечението с rHuEpo през две седмици в експресия на цитохром С в плъхов мускул на плъх ………………………… 143 1.3 Експресия на съдов ендотелен растежен фактор в скелетни мускули на плъхове… .144 1.4 Експресия на миогенни регулаторни фактори в скелетни мускули на плъхове ……………… … .146 1.4.1 Ефект от лечение с rHuEpo в продължение на две седмици върху експресията на MyoD и Myf5 в

1.5 Максимална аеробна скорост при опитни животни. 148

2. Проучване на ефекта от нормобарен протокол за интермитентна хипоксия, в комбинация

анаеробни, по различни хематологични параметри, производителност

експериментиране. 149-163 2.1 Хематологични адаптации при опитни животни ………………………………… 150 2.2 Адаптации

експериментални животни ………………… .153 2.2.1 Експресия на PDK-1 в червен мускул на гастрокнемиус плъх ………………………………… .154 2.2.2 Индукция на защитен ензимен антиоксидант и протеини, реагиращи на стреса при експериментални животни ……………… .155 2.2.2.1

червен плъх gastrocnemius. 156 2.2.2.2

червен и бял гастрокнемиус ……… 157 2.2.3 Индукция на протеини, свързани с процеса на митохондриална биогенеза …………… 159 2.2.3.1 Експресия

червен и бял плъх gastrocnemius ....... 159 2.2.3.2 Експресия на цитохром С в мускулите на плъхове …………………………………………… .160 2.2.3.3 Активност на

цитрат синтаза ензим в

гастрокнемиус плъх червен мускул ……… 162 2.2.4 Максимална аеробна скорост…. 163

3. Сравнително проучване на ефекта от две лечения с rHuEpo (300 IU и 500 IU), срещу интермитиращ протокол за хипоксия

различни хематологични адаптации при опитни животни .... 164-167 3.1 Хематологични адаптации с различните лечения ……………. ……………………… .165

4. Изследване на ефекта на нормобарен протокол за интермитентна хипоксия върху различни

след приложението на rHuEpo при опитни животни .... 168-175 4.1 Хематологични адаптации при опитни животни ……………. 169 4.2 Нива

стимулация на еритроцитите (OFF-Hr резултат) след приложение на rHuEpo …………………… .173

5. Изследване на ефекта от лечението с десмопресин (DDAVP) върху използваните досега хематологични параметри

кръв ……………………. 176-181 5.1 Ефект от прилагането на DDAVP върху хематологичните променливи, наблюдавани от антидопинговите органи .... ...……………… .177 5.2 Ефект от лечението с DDAVP върху концентрацията

общо протеини, креатинин и глюкоза ...... .179

6. Проучване in vitro. Роля на реактивните кислородни видове и PGC-1α в регулирането

индукция на MnSOD в скелетната мускулатура на мишката …………… 182-187 6.1 Ефект на електрическата стимулация върху извънклетъчното окисление на DCFH ………………. 182 6.2 Ефект

антиоксидантно лечение, в експресията на PGC1α и MnSOD ……………………………………. 184 6.3 Ефект от многократната електрическа стимулация и антиоксидантно третиране върху експресията на MnSOD на ниво протеин ………………………… .186

V. Дискусия. 188-234 Обосновка на изследването …………………… .188 1. Проучване на ефекта от лечението с rHuEpo

мускулни и хематологични при експериментални животни ………………… .192-202 2. Изследване на ефекта от протокол за хипоксия