tgf-β

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Индукция на израза на gbb имитира HFD фенотипове в Дрозофила
  • Инхибирането на Gbb сигнализиране спасява индуцирано от HFD затлъстяване и диабетични фенотипове
  • трибъл е цел надолу по веригата на Gbb сигнализация
  • трибъл регулира отрицателно инсулиновата сигнализация
  • на инхибиране на трибъл потиска предизвиканото от затлъстяването gbb и диабетичния фенотип
  • Дискусия
  • Материали и методи
  • Drosophila melanogaster запаси
  • Клетъчна култура, стимулация и трансфекция.
  • HFD и мощност
  • Измерване на телесното ниво на TG
  • Измерване на нивото на трехалоза/глюкоза в хемолимфата
  • Пречистване на РНК и количествен RT-PCR анализ
  • Култура ex vivo на мазнини за възрастни тела
  • Western blot и имунооцветяване
  • Чип
  • Анализ на луцифераза в клетките Дрозофила S2
  • статистически анализ
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

Обобщение

Въведение

Мухите, хранени с HFD, показват ненормални нива на глюкоза и липиди и инсулинова резистентност, подобна на тази, наблюдавана при затлъстели бозайници. HFD-индуцираната инсулинова резистентност се медиира от активността на племенния път на Gbb в мастното тяло. Следователно целенасоченото инхибиране на племенната сигнализация на Gbb представлява нова терапевтична стратегия за лечение на затлъстяване и свързаните с него метаболитни заболявания.

Резултати

Индукцията на експресия на gbb имитира HFD фенотипове при дрозофила

На 14-ия ден от HFD измерихме нивата на експресия на седем лиганди от суперсемейство TGF-β в мастното тяло на възрастната муха. От факторите, които тествахме, само експресията на gbb се увеличи значително чрез HFD хранене (фиг. 1А), особено в мастното тяло (фигура S2A). След това изследвахме дали gbb може да промени нивата на TG в мастното тяло и трехалоза/глюкоза в хемолимфата. Свръхекспресията на gbb в тялото на възрастни мазнини (DCG> gbb) повишава нивата на TG и трехалоза/глюкоза в сравнение с тези на контролните мухи (DCG-Gal4/+) (фиг. 1В). Въпреки това, свръхекспресията на gbb в червата (NP3084> gbb) или в мускула (MHC> gbb) не променя нивото на TG (Фигура S2B). Освен това нивото на pAKT е значително намалено в gbb, получено от мазнини (DCG> gbb), но не и в gbb, получено от червата или мускулите (Фигура S2C).

Свръхекспресията на gbb в тялото на възрастни мазнини (pS106 GS> gbb + RU) значително повишава експресията на Dilp2 и леко увеличава експресията на Dilp3 и Dilp5 по отношение на нивата в контролите -RU (фиг. 1E). За да определим дали gbb регулира инсулиновата сигнализация, ние дисектирахме мастното тяло на възрастни мухи pS106 GS> gbb + RU или -RU и ги лекувахме с инсулин ex vivo (Фигура S2E). В контролите на -RU, лечението с инсулин ex vivo повишава нивото на pAKT спрямо нивото на необработените проби. Напротив, в проби, получени от мухи + RU, които свръхекспресират gbb в тялото на възрастни мазнини, лечението с ex vivo инсулин не повишава нивото на pAKT (фиг. 1F).

За по-нататъшно изследване на регулирането на инсулиновата сигнализация чрез gbb, ние изследвахме субклетъчната локализация на dFOXO в мастните тела на ларвите, използвайки специфичния контролер на мастните тела DCG-Gal4. В тези експерименти, разчленените мастни тела бяха серум гладни и третирани с човешки инсулин ех vivo. В контрола на глада DCG-Gal4 и DCG> gbb мастните тела, dFOXO е локализиран главно в ядрата (фиг. 1G, I). След инсулинова стимулация почти целият протеин dFOXO е преместен в цитоплазмата в контролните мастни тела DCG-Gal4 (фиг. 1Н), докато в мастните тела DCG> gbb по-голямата част от протеина dFOXO все още е в ядра (фиг. 1J). Тези резултати показват, че свръхекспресията на gbb в мастното тяло инхибира инсулиновата сигнализация, което води до инсулиноустойчив фенотип, подобен на този, наблюдаван при дългосрочно HFD хранене.

Инхибирането на Gbb сигнализиране спасява индуцирано от HFD затлъстяване и диабетични фенотипове

( ДА СЕ ) Нивата на триглицеридите и трехалозата/глюкозата в pS106 GS> trb + RU се повишават спрямо тези на контролите −RU. ( Б. ) При HFD, спадът на trb в мастното тяло потиска повишените нива на триглицериди и трехалоза/глюкоза. ( ° С, д ) Елиминирането на trb в мастното тяло, което свръхекспресира gbb (pS106 GS> gbb + trb RNAi + RU), потиска повишените нива на триглицериди и трехалоза/глюкоза, наблюдавани при pS106 GS> gbb + RU. Данните са представени като средно ± sem от поне три независими експеримента. * P 4, 5, което от своя страна причинява вторични заболявания като инсулинова резистентност 6. В това проучване ние демонстрираме, че индуцираното от HFD затлъстяване задейства TGF-β сигнализиране, което понижава регулирането на инсулиновата сигнализация в мастното тяло. Ние също така демонстрираме ролята на трибъл, нова цел на сигнализирането на TGF-β/Gbb, за развитието на инсулинова резистентност.

Моделите на дрозофила са използвани в няколко скорошни проучвания на диета, предизвикано от затлъстяване, инсулинова резистентност, хипергликемия и хиперинсулинемия 29, 30, 31, 32. При ларвите на дрозофила диетата с високо съдържание на захар предизвиква диабетни фенотипи тип 2, които включват хипергликемия, висока TG и инсулинова резистентност 31. По същия начин при възрастни мухи, HFD храненето също предизвиква висок TG и променен метаболизъм на глюкозата, а при бозайниците причинява сърдечни дисфункции като диабетна кардиомиопатия 29. В това проучване установихме модел на дрозофила за индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност, която има поразителни паралели със системата на бозайниците, и я използвахме за наблюдение и изследване на развитието на инсулинова резистентност при условия на хронично преяждане. Освен това, за да проучим подробно фенотипа на инсулиновата резистентност на дрозофила, разработихме система за култивиране ex vivo (Фигура S2E).

Когато хранехме възрастни мухи с HFD, техните краткосрочни и дългосрочни метаболитни отговори бяха различни: например, експресията и секрецията на Dilp2 се увеличаваше от HFD в краткосрочен план, но намаляваше от HFD в дългосрочен план. Инсулиновата сигнализация, която беше анализирана чрез проследяване на активирането на pAKT и експресията на целевите гени dFOXO d4E-BP и dInR, се активира в HFD в краткосрочен план, но не и в дългосрочен план, докато нивата на TG и трехалоза/глюкоза в хемолимфата са били увеличени в дългосрочен план. HFD термин (Фигура S1). Тъй като тези патологични фенотипове при мухите са много сходни с фенотипите, свързани с инсулиноустойчивия диабет при бозайници, заключаваме, че възрастните мухи с HFD могат да се използват като модел за диабет тип 2.

В обобщение установихме модел на инсулинова резистентност към дрозофила и демонстрирахме, че Gbb сигнализирането в мастното тяло играе критична роля в медиираната със затлъстяване инсулинова резистентност чрез регулиране на експресията на племена. Тези резултати предоставят информация за ролята на Gbb/TGF-β сигнализирането при метаболитни заболявания и предполагат, че този път представлява обещаваща терапевтична цел за лечение на затлъстяване и диабет.

Материали и методи

Drosophila melanogaster запаси

Drosophila melanogaster се отглежда и държи при 25 ° C в УНГ, съдържащ 38% царевично брашно, 20% мая, 5% захар и 2% агар. w 1118 мухи са получени от Bloomington Stock Center, pS106 GS -Gal4 от д-р М. Татар, DCG-Gal4 от д-р J. Graff, UAS-gbb, UAS-dpp, UAS-UAS-dActβ и UAS-punt DN от д-р М. О'Конър и UAS-трибъл на д-р М. Милан. Също така получихме линиите на UAS-gbb RNAi, UAS-dMad RNAi и UAS-tribbles RNAi от Ресурсния център на Виена Drosophila. За да се експресира pS106 GS -Gal4, възрастни мухи се култивират на агар-базирана диета, допълнена с 200 μM RU486 (Sigma).

Клетъчна култура, стимулация и трансфекция.

Drosophila S2 клетки, закупени от Invitrogen, се държат при 26 ° C в среда на Schneider, допълнена с 10% телешки серум. HepG2 клетки се култивират в 4,5 g/L глюкоза в модифицираната среда на орел на Dulbecco (DMEM), допълнена с 10% фетален говежди серум, 2% L-глутамин, 100 mU/ml пеницилин и 100% стрептомицин/ml в 5% атмосфера на CO2 при 37 ° С. Културната среда се сменя на всеки 2-3 дни. Преди третиране с пептиди, клетките се гладуват в продължение на 8 часа в безсерумна среда, съдържаща 0,5% BSA, и се третират предварително с химичен инхибитор или носител. TGF-β и TGF-β RI киназен инхибитор II (10 mM, Calbiochem) са използвани в тези експерименти. За трансфекция, клетките се отглеждат в растежна среда без антибиотици и се трансфектират с малка интерферираща РНК (siRNA), използвайки Xtreme GENE HP (Roche). За свръхекспресия на gbb, кДНК с пълна дължина на gbb беше клонирана във вектора pAc5 (Invitrogen).

HFD и мощност

HFD се приготвя чрез добавяне на 20% (обем/обем) кокосово масло към NCD; Тези съотношения бяха използвани във всички експерименти с HFD. HFD се прилага на мъжки мухи, събрани на възраст 3-5 дни.

Измерване на телесното ниво на TG

Тридесет тела на възрастни мухи бяха събрани и хомогенизирани и нивата на TG бяха измерени с помощта на комплект за определяне на триглицеридите (Sigma). Нивата на TG се нормализират до общите нива на протеин.

Измерване на нивото на трехалоза/глюкоза в хемолимфата

Хемолимфата се събира от 20 мухи и се измерват концентрациите на трехалоза/глюкоза, както е описано по-рано 40 .

Пречистване на РНК и количествен RT-PCR анализ

Мазнини бяха събрани от 20 мухи за приготвяне на РНК. Тоталната екстракция на РНК и количествената RT-PCR се извършват, както е описано по-рано 23. Нивата на mRNA са изразени като промяна в пъти спрямо съответното ниво на rp49 mRNA, използвана като вътрешен контрол за нормализиране. За анализ на данните е използван методът за сравнителен цикъл на прага (Ct) (User Bulletin 2, Applied Biosystems). Грундовете, използвани в това проучване, са изброени в допълнителна таблица 1.

Ex vivo култура на мазнини за възрастни

Възрастните мастни тела се дисектират в среда на Шнайдер, гладуват в продължение на 8 часа в среда без серум, съдържаща 0,5% BSA, и се инкубират за 1 час в среда на Шнайдер, съдържаща човешки инсулин (100 nM, GIBCO).

Western blot и имунооцветяване

Общият протеин от възрастни мастни тела се изолира в Drosophila хомогенатен буфер (10 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 10% глицерол и инхибиторен коктейл от протеаза [Sigma]). Уестърн петна се извършват, както е описано по-рано 22. Първичните антитела на фосфо-AKT и dAKT (и двете използвани при 1: 1000) са получени от Cell Signaling, а конюгираните с пероксидаза от хрян анти-заешки IgG вторични антитела (1: 2000) са получени от Santa Cruz Biotechnology. Имунооцветяването се извършва, както е описано по-горе 41 с първичното антитяло dFOXO (1: 200; подарък на д-р М. Татар) и вторичното анти-заешко IgG антитяло Alexa 488 (1: 200, молекулярни сонди).

Клетките се фиксират в 0,5% формалдехид за 15 минути. Анализът на ChIP се извършва, както е описано 23. След изолиране на ядрата и обработка с ултразвук за хроматин, аликвотна част от ДНК се отстранява като входен контрол, а остатъкът се инкубира с нормален миши IgG (2 μg, Santa Cruz Biotechnology) или миши anti-dMad (2 μg, Santa Cruz Biotechnology) Традиционните PCR и qPCR се провеждат с използване на входна ДНК и имунопреципитирана ДНК. Грундовете, използвани в това проучване, са изброени в допълнителна таблица 2.

Анализ на луцифераза репортер в S2 клетки на дрозофила

За тестове с луцифераза, те бяха амплифицирани чрез PCR PCR, субклонирани в луциферазния репортерен вектор pGL3 (Promega) и 1,4 kb геномна ДНК нагоре по веригата на Drosophila trb (+60 до -1346) и 1, 1 kb (+60 до -1054 ). trb1.4kb и pGL3-trb1.1kb. pGL3-trb1.4KbΔMbs, конструкцията за делеция на предполагаемата последователност на Mad junction (GACATCCGTCTG) в pGL3-trb1.4Kb, е генерирана от PCR на припокриване с удължаване, използвайки праймери, които се намират на отстраняващи фланкиращи последователности 42. Тези ДНК конструкции и протеиновият експресионен вектор pAc5.1A-gbb или pAc5.1A бяха трансфектирани в Drosophila S2 клетки с Xtreme GENE HP (Roche). След 48 часа клетките се събират и се измерва активността на луциферазата, като се използва Luciferase Reporter Assay System (Promega), съгласно инструкциите на производителя. Тестовете бяха повторени три пъти. Грундовете, използвани в това проучване, са изброени в допълнителна таблица 2.

статистически анализ

Всеки експеримент се повтаря най-малко три пъти и данните са представени като средно ± sem t-тест на Student е използван за статистически анализи и P