Източник: Съвет за научно, хуманистично и технологично развитие на Универсидад Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA, Венецуела)

мастен

Бенефициент: Аура Амирика Лупес-Ортега, Изабел Кристина Мъркес-Алварадо, Алейди Йозефина Арангурен-Пара, Мигел Бнгел Плаза- Кариун и Марна Дивина Мурильо Лупес де Силанес

Ключови думи: Мастен черен дроб, етионин, оксидативен стрес, дисфункция.

Резюме: Във ветеринарната медицина ролята на оксидативния стрес (OS) в животновъдството и репродукцията стана важна поради промяната на двете функции при животни с хепатостеатоза или мастен черен дроб (FL). Това проучване има за цел да определи дали е установено състояние на чернодробна ОС в експерименталния FL, причинен от етионин при възрастни мъжки мишки NMRI и дали чернодробната функция е променена. Използвани са две групи от 10 животни: една контролна и друга, третирани с DL-етионин интраперитонеално при 7,5 mg/20 g телесно тегло. Размерът и характеристиките на FL се определят хистологично и количеството на депата на чернодробните мазнини се определя чрез концентрацията на триглицериди. И двата анализа потвърждават генерирането на хепатостеатоза при мъже, инжектирани с DL-етионин. Продуктите от липопероксидативно разграждане (конюгирани диени (CD) и малондиалдехид (MDA), показатели на клетъчната ОС, са количествено определени спектрофотометрично чрез концентрацията му в чернодробния хомогенат. AST), използвайки търговски комплекти.Индукцията на FL предизвика значително повишаване на CD от 231,18 ± 15,53 µmol/mg протеин до 297,45 ± 23,10 mmol/mg протеин (P

Ключови думи: Мастен черен дроб, етионин, оксидативен стрес, дисфункция.

Оксидативният стрес (OE) участва във възпалителни процеси, както и чернодробни заболявания, отчитат се високи концентрации на реактивни O2 видове (ROS) [18], а произходът на увреждането на черния дроб е свързан със съществуването на свободни радикали (RL), които може да липопероксидира клетъчни компоненти като мембрани и да причини промени, които водят до загуба на клетъчната функция. При NAFLD чернодробната функция е засегната, както е експериментално определено [13]. Настоящото проучване има за цел да установи дали в експерименталния HG, причинен от етионин при лабораторни мишки-албиноси (Mus musculus Linnaeus, 1758) NMRI за възрастни мъже, е установен EO статус в черния дроб, както и да определи количествено възможната промяна във функцията каза органът.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

За това проучване бяха използвани мъжки мишки от популацията на лабораторни мишки албиноси, по-специално от щама NMRI, от Централното животновъдно съоръжение на Университетския Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), Венецуела. Чрез просто произволно вземане на проби бяха избрани 20 възрастни мъжки мишки със средно телесно тегло 27,5 ± 1,5 грама (g) по скала на Ohaus (Tripe Bean Balance, 700 Series, Florham Park, NJ, USA), поставени в индивидуална неръждаема стомана клетки, при светлинни цикли от 12 часа (час) светлина/12 часа тъмнина в стандартизираните условия на Биотерия на Изследователския отдел по функционални науки "Д-р Хайти Мусач" (UNIHM) Декан на науките UCLA Ветеринарна медицина (DCV). С безплатен достъп до вода и търговски фураж за мишки Ratarina® (Protinal, Венецуела). Изследването е проведено в съответствие с Кодекса за биоетика и биобезопасност на FONACIT-Венецуела [10].

Индукция на безалкохолен HG:

Животните бяха разпределени на случаен принцип в две групи от по 10 животни всяка: контролна група и друга, инжектирана с DL-етионин (Sigma Chemical Co., МО, САЩ), разтворен в стерилен физиологичен разтвор, прилаган i.p. в дози от 7,5 mg/20 g телесно тегло. Контролите се инжектират само с носителя (стерилен физиологичен разтвор). И двете групи бяха подложени на 48-часов пост с безплатен достъп до питейна вода.

Вземане на проби, определяния:

След гладуване в продължение на 48 часа, мишките чрез кокцигеална венепункция се получава кръвна проба, обработена с етилендиамин тетраоцетна киселина (EDTA) -Na 2% антикоагулант. Плазмите се разделят чрез центрофугиране (800 g, 20 4 минути) в хладилна микроцентрифуга Eppendorf 5402 (Brinkman Instr., NY, USA) и се държат в хладилник Mabe RMT, 41XMVEB (Колумбия). След като кръвната проба беше получена, животните бяха евтаназирани под лека анестезия с етер. Черният дроб се дисектира, оценява се макроскопският му вид и се поставя в 250 mM трис-захарозен буфер рН 7,2 при 4 ° С. 1.5 g черен дроб се хомогенизира с 3 пъти теглото му в Tris-захарозен буфер при 4 ° C в NSI-12 Bodine potter (Electric Comp., Chicago, USA). Супернатантът на хомогената, разреден 1:40 с дейонизирана вода, се държи в хладилник до момента, в който са приложени съответните анализи.

Определяне на величината и характеристиките на HG: Малка част от черния дроб, фиксирана в 10% буфериран формалин, е използвана за неговото хистопатологично изследване, проведено в лабораторията по патологична анатомия на ветеринарна болница „Dr. Humberto Ramnrez Daza “от DCV-UCLA. Получени са 4 микронови среза на тъканта с помощта на микротом Jung AG (Хайделберг, Германия) и последващо оцветяване на срезовете с хематоксилин-еозин съгласно конвенционалната техника.

Количество отлагане на чернодробни мазнини: В разредената супернатанта на чернодробния хомогенат концентрацията на триглицериди се определя чрез ензимен метод, използвайки комплект Qualitest (Ind. Qualitest, Каракас, Венецуела). Резултатите са изразени в милиграми (mg) триглицериди/mg протеини, които са определени с помощта на комплекта Pierce (ILL, САЩ) въз основа на техниката на Брадфорд [5].

Количествено определяне на липопероксидативните продукти на разграждане: В супернатантата на чернодробния хомогенат се определя концентрацията на конюгирани диени (DC), чрез техниката, описана от Wallin [22], както и концентрацията на малондиалдехид (MDA) с помощта на TBARS (реактиви с барбитурат 2-тио киселина) съгласно Ohkawa [21].

Определяне на увреждане на чернодробната функция: В плазмата се определя активността на аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST), като се използват търговски комплекти (Wiener lab, Rosario, Аржентина). Всички спектрофотометрични показания са извършени на Genesys 5 (NY, САЩ).

Статистически анализ на резултатите: Извършен е с помощта на статистическия софтуер SPSS (Статистически пакет за социални науки или Статистически решения за продукти и услуги) версия 17.0 за Windows. Резултатите са изразени като средна стойност на стойностите ± стандартна грешка. За да се установи статистическата значимост на резултатите, беше използван тестът на t на студента, изискващ 95% сигурност (P РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

На фиг. 1А показва макроскопичния външен вид на контролния възрастен мъжки NMRI черен дроб на мишка с тъмен оттенък, а на фигура 1В черния дроб на животно, инжектирано с DL-етионин, който има светъл цвят за разлика от контролното животно. Хистологичното изследване на черния дроб на контролни възрастни мъжки NMRI мишки показва чернодробни клетки с нормален външен вид (ФИГ. 1С). Въпреки това, в черния дроб на мишки, лекувани с DL-етионин, се наблюдава умерена метаморфоза на чернодробната мастна тъкан, с големи и малки цитоплазматични вакуоли в хепатоцитите и наличие на мегалоцити и печатни пръстеновидни клетки (ФИГ. 1D).

Оксидативен стрес: количествено определяне чрез DC и MDA

Оксидативният стрес се определя количествено от чернодробните нива на конюгирани диени (DC) и малондиалдехид (MDA). Беше забелязано, че DC са значително повишени (P, КОНЦЕНТРАЦИЯ НА ЧЕРНИЯТА НА: (2A) DC И (2B MDA ПРИ МЪЖКИ НМРИ ВЪЗРАСТНИ КОНТРОЛИ И С DL-ЕТИОНИН-ИНДУЦИРАН HG (7.5 MG/20 G ТЕГЛО НА ТЯЛОТО). СРЕДНАТА ± S ОТ 10 ЖИВОТНИ/ГРУПА; * P

Чернодробно отлагане: количествено определяне на триглицеридите

Черният дроб на мъжки мишки, инжектирани с DL-етионин, показва значително повишение (P HEPBTIC TG КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРИ МЪЖКИ НМРИ ВЪЗРАСТНИ КОНТРОЛИРАНЕ И HG-ИНДУЦИРАНИ DL-ЕТИОНИНОВИ МИШКИ (7,5 MG/20 G ТЕГЛО). СТОЙНОСТИТЕ СА СРЕДСТВОТО ± НА 10 ЖИВОТНИ/ГРУПА; ** С

Увреждане на чернодробната функция: количествено определяне на ALT и AST

Прилагането на DL-етионин при възрастни мъжки NMRI мишки е значително увеличено (P ПЛАЗМБТИЧНА АКТИВНОСТ НА АЛТ И АСТАНТРАЗАМИНАЗИ В КОНТРОЛИРАНИ ВЪЗРАСТНИ МИШКИ С ИНДИКИРАНИ ДЛ-ЕТИОНИН HG (7.5 MG/20 G ТЕГЛО) 10 ЖИВОТНИ/ГРУПА; ** С

HG може да бъде сред една от основните метаболитни промени на перипартния говежди [23]. Администрирането на холин при прясно използвани крави предотвратява HG [17].

Експерименталните модели за изследване на NAFLD при лабораторни животни [20] са дали не само важен принос по отношение на вече посочените аспекти, но и във връзка с употребата на терапевтични агенти, особено природни продукти. В настоящото проучване възрастни мъжки NMRI мишки бяха използвани като експериментален модел, при който NAFLD се индуцира от i.p. (7,5 mg/20 g телесно тегло) DL-етионин, етилов аналог на метионин (Met), който измества аминокиселината от нормалните метаболитни пътища, предизвиквайки намаляване на чернодробния АТФ на протеинов синтез и последващото намаляване, сред други - от липопротеини с много ниска плътност (VLDL), които изнасят липиди от черния дроб в кръвта. Трябва да се отбележи, че Met се трансформира в черния дроб на животните чрез действието на ензима Met-аденозилтрансфераза, който катализира превръщането му в S-аденозил-Met [14].

Хистопатологичното проучване на черния дроб на мъжки мишки, прилагани с DL-етионин, доведе до умерена метаморфоза на чернодробната мастна тъкан, с хепатоцити, чиито цитоплазми представляват големи и малки вакуоли в допълнение към наличието на мегалоцити и пръстеновидни клетки. Тези резултати са в съответствие с тези, съобщени при мъжки плъхове Sprague Dawley, хранени с обогатена с фруктоза диета в продължение на пет седмици, които показват хистопатологични промени в черния дроб, характеризиращи се с леки до умерени макро и микровезикуларни мастни натрупвания, с минимални признаци на перисинусоидална фиброза. [Две ]. От друга страна, добавянето в диетата на 0,5% ниацин, терапевтично средство при лечението на дислипидемия и сърдечно-съдови заболявания, обръща хепатостеатозата, индуцирана от диета с високо съдържание на мазнини, давана на мъжки плъхове Sprague Dawley, характеризираща се с изявена микро и макростеатоза с интрахепатални вакуоли с диаметър 4 до 10 mm [11].

Безалкохолната мастна чернодробна болест е може би най-честата причина за повишени серумни аминотрансферази в западния свят, а също и в азиатския свят [4]. Острото или хроничното увреждане на черния дроб неизменно се свързва с повишени плазмени трансаминази аланин аминотрансфераза (ALT), ензим с вътреклетъчно разположение главно цитоплазматично и на аспартат аминотрансфераза (AST), разположен в две вътреклетъчни и митохондриални области на клетката и митохондриите. най-високата концентрация в черния дроб и нейното повишаване се разглежда като специфично за увреждане на черния дроб [12].

В настоящото проучване се наблюдава как при мъжки NMRI мишки, инжектирани с DL-етионин, се установява, че плазматичните активности на ALT и AST са значително повишени в сравнение със съответните им контроли. Тези резултати са в съответствие с други доклади, показващи, че CCl4, мощен хепатотоксичен агент, предизвиква повишаване на серумните параметри на чернодробно увреждане, като ензимите ALT и AST при мъжки плъхове албиноси от щама Wistar [1]. В допълнение, прилагането на CCl4 на мъжки мишки Kunming причинява остра хепатотоксичност, доказана от значително повишаване на серумните ALT и AST и на чернодробните антиоксиданти [7]. Съотношението AST/ALT може да насочва диагнозата по отношение на вида на произведената хепатостеатоза, като по този начин стойност, по-голяма от 2, прави вероятна HG от алкохолно естество [12]. В настоящото проучване при мъжки мишки с HG е получена стойност на AST/ALT от 1,4, резултати, съответстващи на неговата безалкохолна природа.

Според резултатите, получени в настоящото разследване, приложението при мъжки мишки от i.p. DL-етионин в доза 7,5 mg/20 g телесно тегло предизвиква безалкохолен мастен черен дроб (NAFLD), характеризиращ се с умерена метаморфоза на чернодробната мастна тъкан и повишено отлагане на триглицериди в черния дроб. Индуцираният от етионин NAFLD причинява състояние на чернодробен оксидативен стрес и повишени плазмени ALT и AST, което показва чернодробна дисфункция.

Авторите благодарят на Съвета за научно, хуманистично и технологично развитие на Университета Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA, Венецуела), за финансирането, предоставено на това проучване.

1. АБДЕЛ-МОНЕЙМ, А.М .; АЛ-КАХТАНИ, М.А .; ЕЛ-КЕРШ, М.А .; AL-OMAIR, M.A. Извличане на свободните радикали, противовъзпалително/антифибротично и хепатопротективно действие на таурин и силимарин срещу увреждане на черния дроб на плъхове, предизвикано от CCl4. PLOS ONE. 10 (12): e0144509. 2015 г.

2. АКЕРМАН, Z.; ОРОН-ХЕРМАН, М.; ГРОЗОВСКИ, М.; РОЗЕНТАЛ, .T; PAPPO, O.; ВРЪЗКА, G .; SELA, B.A. Индуцирано от фруктоза мастно чернодробно заболяване чернодробни ефекти на кръвното налягане и плазмените триглицеридни редукции. Хипертония 45 (5): 1012-1018. 2005 г.

3. AHMAD, D.; ГУЛФРАЗ, М.; AHMAD, MS; НАЗИР, Н .; GUL, H .; ASIF, S. Защитно действие на Taraxacum officinale върху CCl4, индуцирана хепатотоксичност при плъхове. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 8 (30): 775-780. 2014 г.

4. АЛАМ, S.; NOOR-E-ALAM, S.M .; CHOWDHURY, Z.R.; АЛАМ, М.; KABIR, J. Безалкохолен стеатохепатит при пациенти с алкохолна мастна чернодробна болест в Бангладеш. Свят J. Hepatol. 5 (5): 281-287. 2013.

5. БРАДФОРД, М.А. Бърз и чувствителен метод за количества микрограма протеин, използващ принципа на свързване с протеин-багрило. Аналитик. Biochem. 72: 248-254. 1976 г.

6. BRAUNERSREUTHER, V .; ВИВИАНИ, Г.Л.; MACH, F.; MONTECUCCO, F. Роля на цитокините и хемокините в безалкохолната мастна чернодробна болест. Свят J. Gastroenterol. 18 (8): 727-735. 2012 г.

7. ЧЕН, Р .; ЧЕН, Y .; WANG, Y .; CAI, S.; DENG, L.; LIU, J.; ZHANG, H. Сравнителна оценка на хепатопротективните дейности на Geniposide, Crocins и Crocetin чрез CCl4-индуцирано увреждане на черния дроб при мишки. Biomol. Тер. (Сеул). 24 (2): 156-162. 2016 г.

8. ДОНТАМСЕТИ, S .; BHAVE, V.S.; МИТРА, М.С .; LATENDRESSE, J.R .; MEHENDALE, H.M. Безалкохолният мастен черен дроб сенсибилизира плъховете към хепатотоксичност на въглероден тетрахлорид. Хепатол. 45 (2): 391-403. 2007 г.

9. ФАББРИНИ, Е .; MOHAMMED, B.S .; MAGKOS, F.; КОРЕНБЛАТ, К.М .; ПАТЪРСЪН, Б. В.; KLEIN, S. Промени в мастната тъкан и чернодробната липидна кинетика при затлъстели мъже и жени с неалкохолна мастна чернодробна болест. Гастроентерол. 134 (2): 424-431. 2008 г.

10. НАЦИОНАЛЕН ФОНД ЗА НАУКА, ТЕХНОЛОГИЯ И ИНОВАЦИИ (FONACIT). Стандарт за използване на животни при изследвания. В: Кодекс за биоетика и биобезопасност. 3-ти изд. Каракас, Венецуела. Pp 33-35. 2009 г.

11. ГАНДЖИ, С.Х .; KUKES, G.D .; LAMBRECHT, N .; KASHYAP, ML.; КАМАННА, В.С. Терапевтична роля на ниацин в профилактиката и регресията на чернодробната стеатоза при модел на безалкохолна мастна чернодробна болест при плъхове. Am. J. Physiol. Гастроинтест. Чернодробен физиол. 306 (4): G320-G327. 2014 г.

12. ДЖАНИНИ, Е.Г .; ТЕСТА, Р .; SAVARINO, V. Промяна на чернодробните ензими: Ръководство за клиницистите. Куче. Доц. Д-р J. 172 (3): 367-379. 2005 г.

13. ЛУПЕЗ-ОРТЕГА, А.А .; АРАНГУРЕН, AJ; PLAZA, M.A .; MURILLO, M.D. Оксидативен стрес и анормална чернодробна функция при женски мишки с експериментален мастен черен дроб. Преподобни ветеринар. 25 (1): 7-11. 2014 г.

14. MATO, J.M .; БВИЛА, М.А .; КОРАЛЕС, F.J. Биосинтез на S-аденозилметионин. В: Carmel, R., Jacobsen, D.W. (Eds), хомоцистеин в здравето и заболяванията. Cambridge University Press. Кеймбридж. Стр. 47-62. 2001 г.

15. МАЙЕС, П.А. Транспорт и съхранение на липиди. В: Мъри, Р. К.; Granner, D.K .; Mayes, PA; Родуел В.В. (Eds), Harper® Biochemistry. 25th Ed, Appleton & Lange, Stamford. Pp 268-284; 130-136. 2000 г.

16. НИТАНАЙ, А .; KATOH, N .; OIKAWA, S .; SAITOH, М.; ХАМАДА, М.; КУЦУЗАВА, А.; МОХАМЕД, Т.; UCHIDA, E.; ENDOH, D.; КУРОСАВА, Т.; SATO, H. Намаляване на концентрацията на серумен аполипопротеин C-III при крави с индуциран от етионин мастен черен дроб. J. Vet. Med. Sci. 66 (9): 1113-1118. 2004.

17. ROVERS, M, Кетоза при млечни крави и ролята на хълма. MG Mundo Ganad. 5 (257): 58-60. 2014 г.

18. SINGAL, A.K.; JAMPANA, S.C .; WEINMAN, S.A. Антиоксидантите като терапевтични средства при чернодробни заболявания. Черен дроб. Internat. 31 (10): 1432-1448. 2011 г.

19. SUTHAR, V.S.; КАНЕЛАС-РАПОСО, Дж .; ОТ НИЗА .; HEUWIESER, W. Преобладаване на субклиничната кетоза и връзките със следродилните заболявания при европейските млечни крави. J. Dairy Sci.96 (5): 2925-2938. 2013.

20. ТАКАХАШИ, Y .; SOEJIMA, Y .; FUKUSATO, Т. Животински модели на неалкохолна мастна чернодробна болест/неалкохолен стеатохепатит. Свят J. Gastroenterol. 18 (19): 2300-2308. 2012.

21. OHKAWA, H .; ОХИШИ, Н.; YAGI K. Анализ за липидни пероксиди в животински тъкани чрез реакция на тиобарбитурова киселина. Аналитик. Biochem. 95 (2): 351-358. 1979 г.

22. УОЛИН, Б .; РОЗЕНГРЕН, Б .; ШЕРЦЕР, Н .; CAMEJO, G. Окисляване на липопротеини и измерване на образуването на реагиращи вещества с тиобарбитурова киселина в единична микротитърна плоча: Използването му за оценка на антиоксидантите. Аналитик. Biochem. 208 (1): 10-15. 1993 г.