нова

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • материали и методи
  • Пациенти
  • Генетични изследвания
  • Картографиране на хомозиготността
  • Секвениране и анализ на екзоме
  • Капилярно базирано секвениране
  • Функционални изследвания
  • Клетъчна култура и анализ на зарастване на рани.
  • Извличане на РНК и RT-qPCR в реално време
  • Уестърн петно
  • Анализи за оцеляване на клетките
  • Резултати
  • Генетични изследвания
  • Функционални изследвания
  • Дискусия
  • Присъединяване
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура
  • Word документи
  • Допълнителна информация

Субекти

  • Генетична вариация
  • Проучвания за асоцииране в целия геном
  • Рак на кожата

Обобщение

Въведение

Въпреки големите стъпки в разрешаването на генетичните причини за човешките заболявания, се появиха нови предизвикателства. Традиционните генетични изследвания преминават от фенотипизиране към генотипизиране. При изследването на редки и сложни заболявания с голяма фенотипна и/или генетична хетерогенност, тази стратегия може да се провали. От развитието на новите технологии, особено последователността от следващо поколение, се появи нов подход към изследването на генетични заболявания, наречен обратен фенотип. 1 Това се състои в разкриване на генетичната причина за заболяване чрез определяне на това кои фенотипове възникват в резултат на определени генетични последователности. Секвенирането от следващо поколение е много мощен диагностичен инструмент при секвениране на екзоми и може да се използва за определяне на генетичните причини за много редки и сложни нарушения. 2 Последователността от следващо поколение също позволява стъпка напред в обратния фенотип. 3 Някои примери за обратния фенотип се появяват в литературата. Четири пет

Дисхроматозата, която се характеризира с наличието на хиперпигментирани и хипопигментирани макули, е пример за рядко и сложно разстройство с голяма фенотипна хетерогенност. При това заболяване са описани два припокриващи се синдрома: наследствена симетрична дисхроматоза (HSD) и наследствена универсална дисхроматоза. 6 Генетичните причини са разнородни и са докладвани както автозомно доминиращо, така и рецесивно наследяване. 6, 7 Причинни хетерозиготни варианти вече са идентифицирани в три гена: SASH1, DSRAD и ABCB6. 8, 9, 10

Тук представяме нов пример за обратен фенотип, който ни позволи да идентифицираме хомозиготни варианти в SASH1 като вероятната причина за нова генодерматоза, покрита с DSH.

материали и методи

Пациенти

Родословие ( да се ), клиничен ( б - з ). Забележете в пробанда (III-6), малките хипо и пигментирани макули по лицето и багажника ( б, ° С, и ), докато анормалният модел на пигментация е по-голям и по-неправилен в крайниците на горните и долните крайници, където има ретикуларен вид ( F, ж ). Също така обърнете внимание на дифузна алопеция на скалпа, миглите и веждите ( б, ° С ), дистрофия на ноктите ( F, ж ), дифузна палмоплантарна кератодермия с лошо определени граници и дебела скала ( д ). Подобни модели съществуват в крайниците на засегнатата сестра III-3 ( з ).

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Засегнатата сестра на пробанд III-3, 39-годишна жена, е имала нормална кожа при раждането. Той е претърпял косопад, който също е засегнал веждите и миглите му на възраст от 6 месеца. Това беше последвано от появата на лющене на дланите на ръцете и стъпалата. Хипопигментирани и хиперпигментирани макули прогресивно се появяват на гърба на ръцете, краката и лицето. На 35-годишна възраст той представи SCC в дясната си предмишница, което изисква ампутация. При последния клиничен преглед на възраст от 38 години той представи хипо и хиперпигментирани шарки на гърба на ръцете и краката (Фигура 1: h), с лека хиперпигментация на краката и предмишниците. В останалата част на тялото няма дефекти на пигментация, но пациентът споменава, че за разлика от засегнатия си брат, тя е била извън слънцето от ранно детство. Тя също имаше суха кожа на стъпалата на краката и дланите с лющене, алопеция и дистрофични нокти, особено ноктите на краката. Зъбните му зъби, космите на пубиса и подмишниците и пубертетът бяха нормални.

Генетични изследвания

Картографиране на хомозиготността

Генотипът на единичния нуклеотиден полиморфизъм (SNP) с геном е извършен при индивиди II.1, II.2, III.3 и III.6, като се използва матрица за картографиране на 250K Nsp на човека (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Данните за изображения бяха обработени с конзолата за генотипиране Affymetrix (GTC v4.1), за да се определят SNP повиквания и да се копират вариации на номера. Картографирането на хомозиготността се извършва с помощта на картографиране на хомозиготност. 11 Разглеждат се само хомозиготни региони с размер над 1 мегабаза.

Секвениране и анализ на екзоме

Капилярно базирано секвениране

Проведено е капилярно секвениране, за да се потвърди хомозиготният вариант SASH1 и да се анализира сегрегацията на варианта в рамките на пет други членове на семейството (родители, засегнатата сестра и двама от незасегнатите братя III-4 и III-7). Номерът на частта на SASH1 беше NM_015278.3.

Функционални изследвания

Клетъчна култура и анализ на зарастване на рани.

Извличане на РНК и RT-qPCR в реално време

Общата РНК беше извлечена с помощта на TRI реагент (Sigma), съгласно протокола на производителя. СДНК от първа верига беше синтезирана от 500 ng обща РНК с помощта на комплекта за синтезиране на cDNA от първа верига на Maxima RT-qPCR от Fermentas (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Разтворът qPCR в реално време съдържа 2 ng обща транскрибирана обща РНК, 300 nm правата и обратната праймери и SYBR зелен буфер (Fermentas) за краен обем от 20 µl. PCR се провеждат в три екземпляра в 96-ямкови плаки, като се използва LightCycler 480 (Roche). Човешката глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) се използва като инвариантна контрола. Последователностите на праймерите, използвани за PCR в реално време, бяха SASH-1-For: ACCTGTTTCTCCGACGTGTG, SASH-1-Rev: GCCAAGCGACTCTTCGATCT GAPDH-For: TGCACCACCAACTGCTTAGC, GAPDH-Rev: GGGTGGG.

Уестърн петно

Клетките се лизират в продължение на 20 минути върху лед в RIPA буфер (50 µM Tris, 150 µM NaCl, 1 µM NaF, 0,1% NP40, 0,25% DOC, 1 µM Na 3 VO 4, 1 µM PMSF и инхибиторен протеинов коктейл (Sigma)) . След центрофугиране при 13 000 g при 4 ° С в продължение на 20 минути се определят концентрациите на протеин с помощта на BCA протеинов анализ (Sigma). Протеините бяха пуснати на 10% SDS-PAGE и прехвърлени в Immobilon-P мембрана (Millipore, Bedford, МА, САЩ). Мембраната беше изсушена с антитела срещу SASH-1 (Sigma). Белязаните белтъци бяха открити с помощта на ECL реагент (Pierce, Thermo Scientific) съгласно препоръките на производителя. Лентите в Western blots бяха визуализирани с помощта на образната система ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Анализи за оцеляване на клетките

Тъй като е доказано, че моделът на фосфорилиране на SASH1 зависи от различни дози йонизиращо лъчение с ниска и висока интензивност от кожни фибробласти, ние предположихме, че мутантните фибробласти на SASH1 може да са по-чувствителни както към ултравиолетовото лъчение (UV), така и към йонизиращото. 14 фибробласти SASH1 и контролни фибробласти от див тип AS405 бяха отгледани в DMEM + 10% FBS при 37 ° С. Един ден след трипсинизация клетките бяха изложени на 0, 7, 5 и 15 J/m 2 UVC в отсъствието на среда. Клетките се отглеждат в продължение на 4 дни, промиват се с PBS и прилепналите клетки се трипсинизират и се преброяват с брояч на частици Z1 Coulter (Beckman Coulter, Lund, Швеция). Клетъчната преживяемост се изчислява като съотношение на броя на клетките, преброен след излагане на ултравиолетови лъчи, към броя на клетките при липса на облъчване. Процентът на оцелелите SASH1 фибробласти е сравнен с процента на оцелелите контролни AS405 клетки.

За да се оцени чувствителността към йонизиращо лъчение, контролните фибробласти SASH1 и AS405 бяха отгледани в DMEM + 10% FBS при 37 ° C. Един ден след посяването клетките бяха облъчени с 0, 2 или 6 Gy, използвайки гама облъчвател с източник на цезий. След 3 дни клетките бяха преброени и клетъчната жизнеспособност беше определена с анализа за изключване на Trypan blue. Клетъчната преживяемост се изчислява като процент на жизнеспособните клетки след гама облъчване спрямо не-облъчените клетки. Процентът на оцелелите SASH1 фибробласти е сравнен с този на оцелелите контролни фибробласти AS405.

Резултати

Генетични изследвания

Картографирането на хомозиготността в целия геном идентифицира седем локуса, обхващащи 75 мегабази и припокриващи 710 гена RefSeq (допълнителна таблица 1). В случая с индекса (III.6) четири редки кодиращи хомозиготни варианта, включително безсмислена промяна в SASH1 (chr6: g.148855021G> A; c.1849G> A; p.Glu617Lys), са разположени в тези региони. Таблица 2) SASH1 кодира кандидат-туморен супресор от семейството на SLY сигнални протеини. 15, 16, 17, 18, 19, 20 Този вариант отсъстваше от Exome Variant Server, dbSNP и локални екзоми, предвижда се вредно от Condel и евентуално вредно от Polyphen2, и идва от добре запазена последователност (GERP консервационен резултат: 5090) (вж. Уеб ресурси). Анализът на съвместната сегрегация при всички налични роднини потвърждава тяхното присъствие в хомозиготно състояние и при двамата засегнати пациенти (III.6 и III.3), в хетерозиготно състояние и при двамата родители, и при незасегнат брат (III7) и липсва при незасегнатите сестра (III4). Вариантите бяха подадени в базата данни ClinVar (присъединителен номер на ClinVar SCV000172081).

Таблица в пълен размер

Функционални изследвания

Тъй като е доказано, че SASH1 пречи на клетъчната миграция, 21 извършихме анализ за заздравяване на рани и демонстрирахме, че фибробластите на пациента могат да мигрират по-добре в раната, отколкото контролните фибробласти (Фигура 2). Пролиферацията на SASH1 фибробласти беше в същия диапазон като тази на контролните фибробласти (средно за три контроли) (допълнителна фигура 1.1). Нивата на SASH1 протеин в фибробластите на пациентите и контролните фибробласти изглеждат нормални (данните не са показани). Количественото определяне на SASH1 cDNA разкри нормални нива на експресия на иРНК в контролните и пациентите фибробласти (допълнителна фигура 1.2). Не са открити разлики между див тип и мутантни фибробласти по отношение на чувствителността към йонизиращо лъчение и UV лъчи по време на тестове за оцеляване на клетките (допълнителни фигури 1.3 и 1.4).

Анализ за заздравяване на рани, извършен върху контролни фибробласти и пациент: контролни фибробласти ( да се ) и фибробласти на пациента ( б ) веднага след нараняване; контролират фибробластите ° С ) и фибробластите на пациента ( д ) 16 часа след нараняване. Вертикалните линии ограничават раната с ширина, равна на (1, 2), докато фибробластите на пациента показват по-голям миграционен капацитет от контролните клетки, 16 часа след раната ( ° С, д ).

Изображение в пълен размер

Дискусия

Представяме автозомно-рецесивен синдром, който не е описан по-рано, характеризиращ се с комбинация от абнормен пигментационен модел (хипо и хиперпигментирани макули на багажника и лицето и зони на ретикуларна хипо и хиперпигментация на крайниците), алопеция, палмоплантарна кератодермия, дистрофия на ноктите и SCC повтарящи се.

В съответствие с появата на карцином при засегнати лица в това проучване, наскоро беше съобщено, че SASH1 участва в туморогенезата на различни видове рак. 15, 16, 17, 18, 19, 20 Клетъчните експерименти показват, че SASH1 се намира в ядрото и цитоплазмата на епителните клетки и може да регулира клетъчната миграция и адхезия, чрез ролята си в изпъкнали мембранни структури. 21 Чрез основния си домейн SH3, SASH1 взаимодейства с актиновия цитоскелет и особено кортикактина, важен регулатор на динамиката на актиновите нишки. 21 Анализът на клетъчната миграция показва, че фибробластите с варианти на SASH1 могат да мигрират по-добре от контролните клетки. Необходима е обаче допълнителна функционална работа за определяне на точния молекулен механизъм.

По отношение на предразположението към алопеция и рак на кожата, може да има ненормално взаимодействие между SASH1 и TRAF6. Съобщава се, че SASH1 е регулатор на TRAF6 убиквитинирането и наскоро е идентифициран de novo хетерозиготен вариант в TRAF6 при пациенти с хипохидротична ектодермална дисплазия. 25, 26, 27 TRAF6, първоначално идентифициран като регулатор на NF-кВ, също има важна роля в туморогенезата, инвазията и метастазите, модулирайки различни сигнални пътища. 28, 29, 30 И накрая, тъй като наскоро се съобщава, че SASH1 е скелетна молекула, участваща в ендотелната сигнализация на TLR4, която участва в вродени имунни отговори, се чудим дали палмоплантарна кератодермия и алопеция може да се дължат на хронична гъбична инфекция, но това хипотезата беше изключена. 25

Дерматологичните заболявания предоставят ключови примери за заболявания с варианти в същия ген, които могат да следват автозомно доминиращо или рецесивно наследяване. Например, анхидротичната ектодермална дисплазия се причинява от вариантите EDAR и EDARADD, които предизвикват рецесивна загуба на функция и доминиращи негативни ефекти. 31 32, 33 При рецесивен начин на наследяване, хетерозиготните индивиди нямат симптоми, докато хомозиготните пациенти показват по-тежък фенотип от пациентите с автозомно доминиращ начин на наследяване. 33, 34 Предполагаме, че хомозиготният безсмислен вариант SASH1 може да доведе до припокриващ се, но по-тежък фенотип от публикуваните по-рано хетерозиготни варианти, свързани с DSH, и че безсмисленият вариант p.Glu617Lys може да бъде свързан със заболяването само в един етап хомозиготен . SASH1 не е изследван в случаи с автозомно-рецесивен DSH.

Клиничното представяне на семейството не съответства на нито един известен клиничен обект. RTS вече е изключен и има някои припокриващи се характеристики с пигментната ксеродерма (Таблица 1), но този синдром е изключен поради нормалната чувствителност към UV светлина. Интересното е, че пациентите също така показват известно припокриване със синдрома на Olmsted, автозомно доминиращо образувание, дължащо се на хетерозиготни варианти на TRPV3. Синдромът на Олмстед свързва двустранна осакатяваща палмоплантарна кератодермия, дифузна алопеция, ониходистрофия и повишен риск от SCC в кератотични области. Въпреки това, пигментни лезии никога не са били открити в този обект, докато се съобщава за свиване на цифри и периорифициални кератозни плаки. 35

В заключение докладваме за нова автозомно-рецесивна генодерматоза, свързана с безсмислени варианти на SASH1 и характеризираща се с поразителната асоциация на анормален пигментационен модел, който се припокрива с DSH, алопеция, палмоплантарна кератодерма, дистрофия на ноктите, аномалии на зъбите и предразположение към SCC. Ще бъде необходима характеристика на допълнителни семейства с подобни клинични характеристики, за да се очертае допълнително тази отличителна клинична единица. Взети заедно, нашите открития разширяват фенотипния спектър, свързан с вариантите на SASH1, и подчертават стойността на секвенирането на екзомите и обратния фенотип при разкриване на генетичните причини за редки и сложни заболявания.