активността

  • Обобщение
  • Цел:
  • Методи:
  • Резултати:
  • Завършеност:
  • Въведение
  • материали и методи
  • Животни и експериментален дизайн.
  • Събиране и обработка на тъкани.
  • Биохимичен анализ
  • Хистологично и имунохистохимично оцветяване.
  • TdT-медиирани никелови dUTP тестове за етикетиране на място
  • Уестърн петна
  • статистически анализ
  • Резултати
  • Блокирането на активността на TLR2 намалява и стабилизира атеросклеротичните лезии в брахиоцефалната артерия
  • TLR2 блокадата отслабва възпалението в атеросклеротичните артерии
  • TLR2 блокадата намалява апоптозата на макрофагите и експресията на CHOP при напреднали атеросклеротични лезии
  • TLR2 медиира ускорено атеросклеротично образуване и регулира експресията на CHOP и апоптозата при ApoE-дефицитни мишки, хранени с HC диети
  • Дискусия
  • Принос на автора

Обобщение

Цел:

Сигнализирането за подобен на рецептор 2 (TLR2) играе критична роля в инициирането на атеросклероза. Целта на това проучване е да се изследва дали блокирането на активността на TLR2 може да доведе до терапевтични ефекти върху напреднала атеросклероза.

Методи:

На възраст от четиридесет седмици мишки с дефицит на аполипопротеин Е (ApoE -/-), хранени с нормална диета, се инжектират интравенозно с TLR2 неутрализиращо антитяло или изотип, съвместим IgG в продължение на 18 седмици. ApoE -/- Tlr2 -/- двойно ударени мишки бяха взети като положителна контрола. В края на леченията се измерват плазмените нива на липидите и се анализират морфологията на плаката, експресията на провъзпалителния цитокин и апоптозата в артериите. Във втората част на това проучване 6-седмични мишки ApoE -/- и ApoE -/- Tlr2 -/- хранеха диета с висок холестерол в продължение на 12 до 24 седмици, нивата на експресия на TLR2 и апоптотични маркери в артериите бяха разгледани.

Резултати:

Блокирането на активността на TLR2 с TLR2 неутрализиращо антитяло или инактивирането на гена Tlr2 не променя нивата на плазмените липиди при ApoE -/- мишки. Фармакологичните и генетични манипулации обаче значително намаляват размера на плаката и стенозата на съдовете и увеличават стабилността на плаката в брахицефалните артерии. Защитните ефекти на антагонизма на TLR2 са свързани с потисната експресия на провъзпалителните цитокини IL-6 и TNF-α и инактивирането на транскрипционните фактори NF-kB и Stat3. В допълнение, блокирането на TLR2 активността отслабва ER-индуцираната от стреса апоптоза на макрофагите в брахиоцефалните артерии, което може да допринесе за разрешаването на некротичните ядра при напреднала атеросклероза. Освен това диетата с висок холестерол ускорява атеросклеротичното образуване и увеличава проапоптотичната експресия на CHOP протеин и апоптозата при мишки ApoE -/-, отколкото при мишки ApoE -/- Tlr2 -/- .

Завършеност:

Фармакологичното или генетичното блокиране на активността на TLR2 намалява и стабилизира напреднали атеросклеротични лезии при ApoE -/- мишки. Следователно насочването на сигнали за TLR2 може да бъде обещаваща терапевтична стратегия срещу напреднала атеросклероза.

Въведение

Атеросклерозата е често срещана причина за сърдечно-съдови заболявания. Сърдечно-съдовите заболявания са водещата причина за смърт и представляват нарастваща заплаха за човешкото здраве в целия свят 1. Епидемиологичните и експериментални проучвания установяват преобладаваща роля за възпалението във всички стадии на атеросклероза, от образуването на ранни стабилни атеросклеротични плаки до напреднали плаки, които са склонни да се разкъсат 2, 3, 4, 5. Наскоро няколко проучвания са фокусирани върху ефектите на фармакологичните интервенции върху стабилността на напреднали плаки, тъй като разкъсването на нестабилни лезии допринася за остър коронарен синдром 4, 6, 7. Нестабилните плаки се характеризират с големи пълни с липиди некротични ядра, капсулирани от тънък влакнест слой, високи нива на противовъзпалителни медиатори и матрични протеази и апоптоза. Развитието на нестабилни плаки е свързано с участието на вродената и адаптивна имунна система.

Toll-подобни рецептори (TLR) са семейство рецептори за разпознаване на модели, които играят ключова роля за вродения имунитет и инициират възпалителни реакции. Лигирането на тези рецептори инициира активирането на ядрен фактор кВ (NF-кВ), което води до експресията на широк спектър от възпалителни гени 8, 9. Сред характеризираните TLRs, TLR2 е уникален поради способността си да хетеродимеризира с TLR1 или TLR6, което води до относително широка лигандна специфичност, която включва както ендогенни, така и екзогенни лиганди. По-специално, всички потенциални ендогенни агонисти на TLR2, включително бигликан, хромозомна кутия протеин 1 с висока подвижност (HMGB1) и окислени липопротеинови компоненти, се намират в атеросклеротични лезии 12, 13, 14. Освен това, сигналният път на TLR2 е свързан със стресовата реакция на ендоплазмения ретикулум (ER). ER стресът може да увеличи експресията на TLR2 in vitro и in vivo, а TLR2 допринася за апоптозата в макрофагите, които са подложени на липидно предизвикан ER стрес. Следователно, TLR2 може да бъде потенциална цел за терапевтични интервенции при лечението на атеросклероза.

материали и методи

Животни и експериментален дизайн.

ApoE -/- Tlr2 -/- мишки са генерирани от хетерозиготни кросоувъри на ApoE -/- мишки (фон C57BL/6, лаборатория Jackson) и мишки Tlr2 -/- (фон C57BL/6, лаборатория Jackson). Генотиповете на хомозиготни двойни нокаутиращи или ApoE единични нокаутни мишки бяха потвърдени чрез PCR, както е описано по-рано 18. Всички животни бяха настанени в стандартни условия на влажност, стайна температура и цикли на тъмна светлина, с достъп до вода и храна по желание. Проучванията са проведени в съответствие с принципите, очертани от Институционалния комитет по етика на грижите и лечението на животните в биомедицинските изследвания (Пекин, Китай).

Събиране и обработка на тъкани.

След като мишките гладуват в продължение на 4 часа, кръвта се получава през ретроорбиталния венозен плексус за измерване на липидите. След това мишките се анестезират, използвайки 50 mg/kg ip пентобарбитал и се перфузират през лявата сърдечна камера с леден студен фосфатен буфериран физиологичен разтвор под физиологично налягане. Аортите бяха бързо изрязани, щракащо замразени от аортната дъга до бифуркацията на илиата и държани при -80 ° С преди анализ на протеина. Цялата брахиоцефална артерия на всяко животно беше фиксирана в 4% параформалдехид в продължение на 24 часа при 4 ° C, вградена в парафин и разделена серийно (с дебелина 5 μm).

Биохимичен анализ

Нивата на общия холестерол, липопротеиновия холестерол с висока плътност (HDL-C), липопротеиновият холестерол с ниска плътност (LDL-C) и триглицеридите в плазмата са определени с помощта на търговски комплекти (Biosino, Пекин, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя. .

Хистологично и имунохистохимично оцветяване.

Всяка пета секция от серийните секции беше оцветена с модифицирано пентахромно петно ​​на Movat или червено Sirius, за да се оцени състава и стабилността на напреднали атеросклеротични плаки в брахиоцефалната артерия и 12-15 секции на мишка бяха анализирани за всяко петно. Оцветените секции бяха заснети при увеличение 200 пъти и 2-3 зрителни полета на участък, съдържащ цялата област на лезиите, бяха заснети и анализирани с помощта на Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Средната стойност на всички секции представлява атеросклеротичната лезия на мишка.

За имунохистохимично оцветяване най-малко 4 участъка от брахиоцефалната артерия на мишка се инкубират с анти-миши макрофагични антитела на плъхове (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), моноклонални антитяла мишки за гладки мускули актин (α-SMA, 1: 100, Санта Круз Биотехнология, Калифорния, САЩ), или заешко антиматрично металопротеиназно (MMP) -2 антитяло (1: 100, Abcam, Cambridge, UK). Свързаните антитела се комплексират с пероксидазно-свързани вторични антитела и се откриват с помощта на диаминобензидин. Оцветените секции бяха заснети при увеличение 200 × и 2-3 зрителни полета, съдържащи цялата площ на лезията на секция, бяха заснети и анализирани с помощта на Image-Pro Plus 5.0. Средната стойност на всички участъци представлява експресията на целевите протеини в атеросклеротичната лезия.

За да се оцени колокацията на макрофагите и хомоложния протеин C/EBP (CHOP), анти-мише макрофага антитяло на плъх (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) И мишка моноклонално антитяло за CHOP (1: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) са използвани като първични антитела. Четири тъканни среза на мишка бяха инкубирани с пилешки плъхове, белязани с Alexa 647, и вторични антитела срещу мишка заек, маркирани с Alexa 488 (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Срезите бяха изобразени с конфокален микроскоп E2000U и оценени със софтуера Leica TCS SP2.

In-situ TdT-медиирани никелови dUTP тестове за етикетиране

Апоптотичните клетки при атеросклеротични лезии бяха открити с TdT-медиираната dUTP техника за маркиране на ник-край (TUNEL), използвайки комплекти (Promega, Madison, WI, USA). Ядрата бяха оцветени с DAPI. TUNEL-положителните ядра са преброени под обърнат флуоресцентен микроскоп на Olympus I720. За да се оцени колокацията на макрофагите, макрофагите бяха открити, използвайки анти-миши макрофагични антитела на плъх (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), последвани от пилешко анти-плъхово вторично антитяло. Набрано с Alexa 647 (1: 200, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ).

Уестърн петна

След тъканна хомогенизация, извлечените протеини се разделят с помощта на 12% SDS-PAGE и се имуноблотират със специфична акула, включително анти-MMP-2 (Abcam, Кеймбридж, Великобритания), анти-фосфо-NF-кВ р65, анти-NF-кВ р65, анти-разцепена каспаза-3, анти-CHOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-phospho-Stat3, anti-Stat3, anti-interleukin (IL) -6, anti-IL-10 или anti -фактор на туморна некроза (TNF) -α (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Вторичните сигнали за антитела бяха открити с помощта на ECL Plus Western Blot Reagents (Amersham Biosciences, PA, USA) съгласно инструкциите на производителя.

статистически анализ

Данните са представени като средната стойност ± SEM. Сравненията между различни групи бяха направени с еднопосочна ANOVA с помощта на SPSS. Данните, които не показват нормално разпределение, са анализирани с помощта на U-тест на Mann-Whitney. P

Блокирането на активността на TLR2 не влияе върху плазмените нива на липидите. Общи нива на холестерол (A), триглицериди (B), LDL-C (C) и HDL-C (D) бяха определени при мишки ApoE -/- на 58 седмици, третирани с физиологичен разтвор, IgG или iv TLR2ab за 18 седмици и при мишки ApoE -/- с дефицит на TLR2 (DK), хранени с диета Chow. Данните са показани като средната стойност ± SEM (n = 12 мишки/група).

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд PowerPoint

TLR2 блокадата намалява и стабилизира напредналите атеросклеротични плаки в брахиоцефалната артерия. (A и B) Оцветяването с Movat показва състава на напреднали лезии на групи, третирани с физиологичен разтвор, IgG и TLR2ab и с дефицит на TLR2. Стрелките показват ерозия на носителя. Скалите представляват 200 μm в панел A и 50 μm в панел B. Прилагането на TLR2ab в продължение на 18 седмици и дефицитът на TLR2 значително намаляват средната площ на лезията (C), максималната стеноза на лезията (D), максималните некротични ядра/плака (E) и минимална средна дебелина (F) при мишки с дефицит на ApoE. L, лумен; М, медия. Данните са показани като средната стойност ± SEM (n = 10 мишки/група). b P

TLR2 блокадата стабилизира напредналите атеросклеротични плаки. В групите, лекувани с TLR2ab и с дефицит на TLR2, оцветяването с червено Sirius разкрива по-високо съдържание на колаген (A). Имунохистохимичното оцветяване разкрива по-обилно разпределение на гладкомускулните клетки (В) и намалено натрупване на макрофаги (С) в лезии на брахиоцефални артерии. Скалите представляват 50 µm. L показва светлината. Данните са показани като средни стойности ± SEM (n = 10 мишки/група). b P c P

Блокирането на TLR2 инхибира съдовото възпаление в атеросклеротичните артерии. Експресията на MMP-2 (A и B), фосфорилирането на NF-κB p65 (C), фосфорилирането на Stat3 (D) и експресията на цитокините IL-6, TNF-α и IL-10 (E) те бяха намалени в групите, лекувани с TLR2ab и с дефицит на TLR2. Скалите представляват 50 µm. Данните са показани като средната стойност ± SEM (n = 6 мишки/група). b P

Диетите с висок холестерол (CH) увеличават експресията на TLR2 в макрофагите, а TLR2 блокадата намалява CH-индуцираната експресия на CHOP и апоптозата при атеросклеротични лезии. (А) Оцветяването с Movat разкри морфология на плаката в брахицефалните артерии на мишки ApoE -/- Tlr2 +/+ и ApoE -/- Tlr2 -/-. Скалите представляват 200 µm. Дефицитът на TLR2 значително намалява средните области на лезия (B) и размерите на некротичните ядра (C) (n = 8 мишки/група). (D) Двойната имунофлуоресценция разкрива инфилтрация на TLR2-експресиращи макрофаги в брахиоцефални артериални лезии на ApoE -/- мишки на възраст 12-24 седмици при атерогенни диети, започващи на 6-седмична възраст. Скалите представляват 20 µm. На посочените възрасти мишките ApoE -/- Tlr2 -/- показват CHOP (E), Bcl-2 (F) и значително разцепват експресията на каспаза-3 (G) в аортите. Данните са показани като средната стойност ± SEM (n = 4-6 мишки/група). b P -/- на същата възраст. e P -/- 12-седмична чау диета.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд PowerPoint

Дискусия

Възпалителните процеси играят основна роля в развитието на атеросклероза. Доказано е, че TLR2 участва в този процес 11, 27. В съответствие с предишни проучвания на ранните етапи на атеросклероза, блокирането на активността на TLR2 намалява инфилтрацията на макрофаги в плаките; експресията на възпалителни медиатори, включително MMP-2, TNF-a и IL-6; и инактивирането на транскрипционния фактор NF-κB 20, 21, 23. Освен това, антагонизмът на TLR2 също инхибира експресията на имуносупресивните медиатори IL-10 и транскрипционния фактор Stat3, което показва, че ползите от блокирането на TLR2 зависят от широкото инхибиране на възпалението. Това проучване предоставя първите доказателства за TLR2-индуцирано възпаление при напреднали лезии, което би допълнило разкритата по-рано роля за TLR2 в ранната атеросклероза.

Нестабилността на плаката е важна характеристика на напредналата атеросклероза. Въпреки че механизмите, лежащи в основата на разкъсването на плаката, остават неуловими, много фактори са показали, че допринасят за този процес, включително натрупване на макрофаги, високи нива на провъзпалителни медиатори, прекомерно активиране на ММР и апоптоза на VSMC и макрофаги. В допълнение към регулирането на възпалителните отговори, ние забелязахме, че TLR2 блокадата намалява апоптозата на макрофагите чрез TUNEL анализ и имунофлуоресценция.

В обобщение, ние показахме, че инактивирането на гена TLR2 в мишки ApoE -/- намалява размера на плаката и повишава стабилността на плаката в брахиоцефалната артерия по време на напреднала атеросклероза в резултат на инхибиране на възпалението и апоптозата. По-специално, лечението на тези мишки с неутрализиращо антитяло TLR2 произвежда благоприятни терапевтични ефекти и може да служи като обещаваща терапевтична стратегия срещу напреднала атеросклероза. Тъй като е необходима засилена експресия на TLR2 в ендотелните клетки за иницииране на заболяването, TLR2 може да медиира или усилва ER-индуцираните от стреса апоптотични сигнали при напреднали атеросклеротични лезии. Нашата работа предполага, че фармакологичното блокиране на сигнализирането на TLR2 е привлекателен подход за бъдещото лечение на атеросклероза.

Принос на автора

Xiao-xing WANG и Zhuo-wei HU са проектирали изследването; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV и Hui-min YAN допринесоха за развитието на методологията; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU и Xiao-ming FU извършиха експериментите; Xiao-xing WANG и Zhuo-wei HU анализираха данните и написаха статията.