естествени

  • Субекти
  • Обобщение
  • Заден план:
  • Методи:
  • Резултати:
  • Завършеност:
  • Главен
  • Резултати
  • Размер на популацията на NK клетки
  • Експресия на интелектин-2 иРНК в NK клетки, изолирани от PBMC
  • NK цитотоксичност на клетките
  • Експресия на NK клетки, свързана с ген в NK клетки, изолирани от PBMC
  • Дискусия
  • Методи
  • Химически продукти
  • bLf
  • Диетично лечение и животински протокол
  • Вземане на проби
  • PBMC изолация
  • Пълна изолация на клетки на далак и MLN
  • Изолация на NK клетки и фенотипна идентификация за чистота
  • Анализ на цитотоксичността на NK клетки чрез поточна цитометрия
  • Фенотипна идентификация на кръвни мононуклеарни клетки и общо MLN клетки и далак
  • Експресия на NK клетъчен ген
  • Статистически анализ
  • Отчет за финансова подкрепа
  • Откровение
  • Допълнителна информация
  • Файлове на Powerpoint
  • Допълнителна фигура S1.

Субекти

  • NK клетки
  • Хранене
  • Педиатрия

Обобщение

Заден план:

Клетките с естествени убийци (NK) са компоненти на вродената имунна защитна система и техните нива се различават при кърмачета и кърмачета, хранени с адаптирано мляко (FF). Лактоферин (Lf) модулира цитотоксичността на NK клетките ex vivo. Ние предположихме, че диетата с говежди Lf (bLf) ще увеличи популациите на NK клетки и цитотоксичността.

Методи:

Прасенца се отглеждат със свине майки (SR), FF или 1 g/l, хранени с bLf (LF) в продължение на 21 дни. NK клетките (CD3 - CD4 - CD8 +) в кръвта (мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC)), далака и мезентериалните лимфни възли (MLN) се определят чрез поточна цитометрия. PBMC NK клетките бяха тествани за цитотоксична активност срещу целеви K562 клетки ex vivo в присъствието на среда (не стимулирана), интерлевкин-2 или bLf. Експресията на NK клетъчна иРНК се определя чрез количествена PCR с обратна транскрипция.

Резултати:

Прасенцата SR и LF са имали повече NK клетки в MLN (P = 0,0097) и далак (P = 0,0980), отколкото прасенцата FF. В PBMC, прасенцата SR са имали повече NK клетки, отколкото прасенца FF (P = 0,0072); Прасенцата LF са междинни и не се различават от прасенца FF или SR. Експресията на NK клетъчен интелектин-2 иРНК е 2,5 пъти по-висока (P = 0,0095) при LF от прасенца SR или FF. NK клетките при прасенца SR проявяват по-висока цитотоксична активност (P

Изобилието на Intelectin-2 иРНК е по-високо в естествените клетки убийци от прасенца, хранени на 21-дневна bLf (LF, n = 3), отколкото при тези, отглеждани със свине майки (SR, n = 7) или хранени формули (FF, n = 6) животни. Нормализираните стойности за интелектин-2 бяха изчислени чрез разделяне на целевото средно количество на средното количество на референтния ген (пептидилпролил изомераза А). Разликата в гънките се изчислява за всяко измерване чрез разделяне на нормализираните целеви стойности на средната нормализирана целева стойност за FF прасета. Данните са изразени като средна стойност ± SD на разликата в гънките по отношение на FF животни. * P ≤ 0,05. bLf, говежди лактоферин.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд PowerPoint

NK цитотоксичност на клетките

NK клетки, изолирани от PBMC от SR животни, нестимулирани или стимулирани с интерлевкин-2 (IL-2) или bLf, проявяват по-висока цитотоксична активност (P

Цитотоксичност на клетките с естествени убийци (NK), изолирани от свине майки, отгледани на 21 дни (SR; n = 11; черно), хранени с формула (FF; n = 14; бели) и хранени с bLf (LF; n = 11 сиви прасенца). NK клетките на периферна кръв (PBMC) бяха или нестимулирани (Unst), или стимулирани с интерлевкин-2 (IL-2) (20 ng/ml) или Lf (25 μg/ml) и инкубирани в продължение на 48 часа с DiOC 18 с етикет K562 целеви клетки с съотношение 10: 1 спрямо съотношението на целевите клетки.Пропидиев йодид (PI) се добавя в края на инкубацията, за да маркира мъртвите клетки. Цитотоксичността се отчита като унищожени целеви клетки (PI + DiOC 18 +) като процент от общите целеви клетки (DiOC 18 +). Данните са изразени като средна стойност ± SD. Пълен модел на обобщен линеен модел (GLM), P † показва значителни разлики между диетите. bLf, говежди лактоферин.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд PowerPoint

Експресия на NK клетки, свързана с ген в NK клетки, изолирани от PBMC

В опит да се определят възможните молекулярни механизми, които биха могли да допринесат за намаляване на цитотоксичната активност на NK клетките на FF и LF животните, беше извършена количествена PCR с обратна транскрипция на РНК, извлечена от CD3 - CD4 - CD8 клетките. + NK от нестимулирана периферна кръв ( Фигура 3 ) Изобилието на перфорин мРНК, ефекторна молекула за NK клетки, е три и шест пъти по-ниско в NK клетки от FF и LF прасенца, съответно, отколкото при SR прасенца (P = 0.0038, Фигура 3а ). В допълнение, експресията на D рецептора на NK член на група 2 (NKG2D), активиращ рецептор, открит в NK клетките и известен като рецептор 1 на подсемейството К на лектиноподобния рецептор на клетки убийци, е 3, 5 пъти по-ниска в NK клетките на FF животни, отколкото в тези на SR животни, докато експресията на NKG2D рецепторния ген в NK клетките на LF животни е междинна и не се различава значително от никоя от групите ( Фигура 3б ).

Изпълнение ( да се ) и NK група 2 член D (NKG2D) рецептор ( б ) Изобилие от иРНК в естествени клетки убийци, изолирани от свине майки, отглеждани на 21 ден (SR, n = 7), хранени с формула (FF, n = 4-5) и прасенца, хранени с bLf (LF, n = 3). Нормализираните стойности за целевите гени бяха изчислени чрез разделяне на желаното средно количество на средното количество на референтния ген. Разликата в гънките се изчислява за всяко измерване чрез разделяне на нормализираните целеви стойности на средната нормализирана целева стойност за FF прасета. Данните са изразени като средна стойност ± SD. Различните индекси (*, †, ‡) показват значителни разлики при P ≤ 0,05. bLf, говежди лактоферин.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд PowerPoint

Дискусия

Като цяло диетата оказва значително влияние върху популацията и активността на NK клетките. Прасенцата, които са били хранени с кърма, са имали по-голям брой популации на NK клетки в кръвта и имунните тъкани и по-висока цитотоксична активност (PBMC) в сравнение с прасенца, които са били FF. Въпреки това, общото въздействие на bLf върху развитието на NK клетки в това проучване не е окончателно. Диетичните добавки на bLf не повишават цитотоксичността на NK клетките; фактът, че прасенцата с LF имат по-голям брой NK клетки с периферна кръв с по-висока експресия на LfR, може потенциално да подобри имунната защита на новороденото. Освен това добавките за повече от 21 дни или повече дози bLf могат да бъдат по-ефективни за засилване на вродения имунен отговор при тези животни, тъй като дозата, използвана в това проучване (1 g/L), е в долния край на наличното. човешко кърма (

2,1 g/l). Следователно са необходими бъдещи проучвания, за да се определи дали имунната регулаторна роля на bLf в активността на NK клетките зависи от определен набор от условия, т.е. патогенно предизвикателство, възраст или вид. Тъй като NK клетките са важна първа защитна линия срещу инфекция, разбирането на факторите, които увеличават броя им и подобряват способността им да убиват, може по-добре да предпази бебетата с FF от инфекция чрез диетични средства.

Методи

Химически продукти

Всички химикали са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури), освен ако не е посочено друго.

Прахообразен bLf (98% чистота) е получен от DMV International (FrieslandCampina, Холандия). Общото съдържание на желязо е 120 mg/kg прах, което би представлявало 11,9% насищане, ако цялото желязо е свързано с bLF. BLf се разтваря в двойно дестилирана дейонизирана вода в концентрация 100 g/l. По време на приготвянето на формулата, 10 ml от този разтвор се добавят към 1 l формула за крайна концентрация от 1 g/l bLf.

Диетично лечение и животински протокол

Вземане на проби

На ден след раждането прасенцата бяха седатирани с интрамускулно инжектиране на телазол (7 mg/kg телесно тегло; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) и кръв беше събрана чрез интракардиална пункция във вакуумни епруветки, съдържащи хепарин (BD Biosciences, San José, CA ) за изолиране на PBMC. Прасенцата бяха евтаназирани чрез интракардиално инжектиране на натриев пентобарбитал (72 mg/kg т.т., Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). След евтаназия се събират проби от далак и MLN за пълна клетъчна изолация.

PBMC изолация

Кръвта се разрежда 2: 1 с RPMI-1640 (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), наслоява се във Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и се центрофугира при 400 g в продължение на 40 минути при 20 ° C. PBMCs събрани от градиентния интерфейс. Червените кръвни клетки се лизират, използвайки лизисен буфер (0.15 mol/L NH 4 Cl, 10 mmol/L KHCO 3 и 0.1 mmol/L Na2 EDTA). PBMC се измиват три пъти в буфер за промиване, съставен от буфериран солев разтвор на Hank (без Ca 2+, без Mg 2+ (HBSS; Invitrogen, Gibco), допълнен с 2% BSA, 1 mmol/L Na 2 EDTA, 50 μg/ml гентамицин (Invitrogen, Gibco), пеницилин 1000 U/ml и стрептомицин 100 μg/ml). PBMCs бяха суспендирани в пълен RPMI-1640 (10% FBS, 2 mmol/L глутамин, 50 μg/ml гентамицин, 1 mmol/L натриев пируват, 20 mmol/L HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин). Броят на жизнеспособните клетки се оценява чрез преброяване след оцветяване с трипан синьо (Invitrogen, Gibco). Клетките бяха фенотипизирани и количествено определени чрез поточна цитометрия или използвани за изолиране на NK клетки, както е описано по-долу.

Пълна изолация на клетки на далак и MLN

Пробите от далак и MLN бяха събрани и съхранявани върху лед в буфер за събиране, съдържащ антибиотици до обработката. Тъканите се измиват три пъти (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 ug/ml гентамицин, 1000 U/ml пеницилин и 100 ug/ml стрептомицин). Измитите тъкани се поставят в С-епруветки (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) с 10 ml буфериран физиологичен разтвор на Hank и се нарязват с помощта на Gentle MACS (Miltenyi Biotec). Получените клетъчни разтвори се филтрират през 100 µm клетъчен филтър (BD Falcon, Сан Хосе, Калифорния), последван от 40 µm клетъчен филтър (BD Falcon). След лизиране на червените кръвни клетки, изолираните клетки се промиват три пъти в промивен буфер и се суспендират в пълен RPMI-1640. Броят на жизнеспособните клетки се оценява чрез преброяване след оцветяване с трипан синьо (Invitrogen, Gibco). След това клетките бяха фенотипизирани чрез поточна цитометрия, както е описано по-долу.

Изолация на NK клетки и фенотипна идентификация за чистота

Анализ на цитотоксичността на NK клетки чрез поточна цитометрия

Фенотипна идентификация на кръвни мононуклеарни клетки и общо MLN клетки и далак

Експресия на NK клетъчен ген

Общата РНК се екстрахира и пречиства от NK клетки, изолирани от PBMC с TRIzol реагент (Invitrogen, Grand Island, NY), следвайки протокола на производителя. РНК се определя количествено чрез спектрофотометрия, използвайки Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL) при 260 nm. Общо 10 милиона NK клетки бяха използвани за екстракция и произведени

800-1000 ng/μl РНК. Концентрацията на РНК се коригира до 0.25 μg/ml, като се използва вода без RNase (Invitrogen) и качеството на РНК се анализира с помощта на биоанализатор (модел 2100; Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния) в Университетския WM Keck Center в Илинойс. Всички проби имаха номер на целостта на РНК> 6.

Обратната транскрипция беше извършена с помощта на термичен циклер Eppendorf (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Всяка реакция съдържа 3 μg обща РНК и 10 μl cDNA комплект за обратна транскрипция на смеси (Applied Biosystems, Foster City, CA), включващ 100 mmol/L дезоксирибонуклеотиден трифосфат (dNTP), 10X RT буфер, 10X RT случайни праймери, MultiScribe Reverse Транскриптаза, инхибитор на RNase и вода за диетилпирокарбонат (DEPC) (Invitrogen) в краен обем от 20 μL.

Количествената PCR в реално време се извършва за ITLN-2 (Ss03374218_m1), KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) и перфорин (Ss03373694_m1) и пептидилпролил изомераза A (Ss03392377_m1), използвайки анализа на Taqman. Пробите бяха подадени на общо 40 амплификационни цикъла на цикъл и интензивността на флуоресценция беше установена с помощта на машина Taqman ABI 7900 (Applied Biosystems). Пептидилпролил изомераза А се използва като референтен ген (31). Резултатите бяха изразени с помощта на относително стандартната крива. Накратко, бяха направени серийни разреждания (1: 5 до 1:15, 625) от запас от сборна свински NK кДНК от свински клетки и течаха върху всяка плака. Всяка проба се пуска в три екземпляра с праймери за оценка на целевия ген и пептидилпролил изомераза А. Нормализираните стойности за всяка мишена се изчисляват чрез разделяне на средната стойност на целевото количество на средната стойност на пептидлипролил изомераза А. Разликата в гънките се изчислява за всяко измерване чрез разделяне на нормализираните целеви стойности на нормализираната проба от калибратора (в този случай средната стойност за групата FF). Всички проби, които са били тествани за статистически разлики, са пуснати на една и съща плоча.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на обобщения линеен модел на Proc в рамките на SAS (Версия 9.2; SAS Institute, Cary, NC). Моделът за NK клетъчна популация и анализи на генна експресия съдържа диетата като основен ефект. Моделът за цитотоксичност на NK клетките съдържа ефекта от диетата, лечението и взаимодействието диета × лечение. Нормалното разпределение на данните беше потвърдено от теста за нормалност в рамките на SAS и число на Шапиро - Уилк ≥0,75 показва, че стойностите са нормално разпределени. Данните се отчитат като средна стойност ± SD. Сравнения с P