Субекти

Обобщение

Въведение

Известно е, че етиологията на затлъстяването е свързана с генерирането на вътреклетъчни липиди, прекомерното натрупване на адипоцити и съхранението на мастна тъкан в тялото като последица от нарушаването на регулацията на енергийната хомеостаза 1. Това метаболитно заболяване може лесно да увеличи риска от смърт чрез появата на различни нарушения и усложнения, като диабет тип 2, хипертония, хиперлипидемия, инсулт, сърдечно-съдови заболявания, мускулно-скелетни нарушения и рак на дебелото черво и др. две. През последното десетилетие честотата на наднорменото тегло и затлъстяването се е увеличила в световен мащаб и се превръща в генерализирана епидемия 3, въпреки разработването на няколко клинични лекарства против затлъстяване за контрол на телесното тегло чрез намаляване на приема на храна, увеличен разход на енергия и промяна. От метаболизма или регулирането на хормоналната хомеостаза 4, 5. Следователно намирането на ефективни терапевтични подходи срещу затлъстяването остава предизвикателство.

Rhizoma Attraylodis Macrocephalae (RAM), известно традиционно билково лекарство, което се използва широко в Източна Азия като храносмилателно, диуретично и антихидротично средство, представлява коренът на Attraylodes Macrocephala Koidz 13. Предишни проучвания също съобщават, че ADR и неговите основни съединения могат да упражняват множество фармацевтични ефекти в експериментални модели, включително анти-рак 14, анти-хепатотоксичност 15, анти-коагулант 16, анти-язва 17, анти-оксидант 18, противовъзпаление 19, и анти-адипогенеза 20. Проучване показа, че водният екстракт от RAM може да упражни ефект срещу затлъстяването чрез модулираното инхибиране на липидното натрупване по пътя Akt/PI3K. Освен това се съобщава, че RAM, ферментирал с Bacillus licheniformis, защитава чревната бариерна функция срещу ендотоксин 18, в съответствие с благоприятното въздействие на пробиотиците и пробиотично-медиираната ферментация върху терапевтичната ефикасност на билките 18, 21. Досега обаче не е докладвано подробно проучване, оценяващо въпроса дали взаимодействието между ADR и пробиотиците или чревната микробиота може да модулира въздействието на ADR срещу затлъстяването.

Тъй като е установено, че процесът на ферментация на билкови състави подобрява терапевтичната им ефективност срещу различни заболявания, 12, 18, 22 предположихме, че ферментиралите билки могат да бъдат по-ефективни от неферментиралите билки срещу метаболитно разстройство. В настоящото проучване, използвайки плъхове, хранени с HFD и клетки 3T3-L1, съответно като модели in vitro и in vivo, ние се опитахме да определим дали въздействието на ADR върху затлъстяването е свързано с промяна в чревната микробна среда и дали ферментира Lactobacillus plantarum RAM (FRAM) във връзка с този пробиотик може да има по-голямо въздействие срещу затлъстяването в сравнение с неферментиралата RAM (URAM). Освен това, тъй като е известно, че нискостепенното възпаление е свързано с развитието и появата на състояние на затлъстяване 23, 24, ние също оценихме противовъзпалителните ефекти на двете билкови формули, споменати по-горе, използвайки плъхове и RAW 264,7 клетъчни линии, както in vivo и in vitro модели за изясняване на вероятните молекулярни механизми, чрез които те могат да упражняват ефекти срещу затлъстяването.

Резултати

URAM и FRAM не повлияват жизнеспособността на клетките при преобладаващите експериментални условия

Лечението с URAM и FRAM при различни концентрации (100, 200 и 400 μg/ml) за 24 часа не повлиява значително пролиферацията на RAW 264.7, 3T3-L1 и HCT 116 клетки в сравнение със съответната нормална група (Фиг. S1).

URAM и FRAM променят телесната маса и мазнините на плъхове, третирани с HFD + LPS

Лечението с HFD и HFD плюс LPS при плъхове води до значително увеличение на телесната маса и теглото на коремната, епидидната и общата мастна тъкан в сравнение с нормалната група (P 25, 26 и че повишаването на чувствителността към инсулин може да доведе до намаляване в отлагането на мазнини в тъканите.27, 28, 29 Тези открития ни накараха да разширим нашето проучване, за да оценим дали URAM или FRAM могат да подобрят инсулиновата чувствителност (измерена по отношение на консумацията на глюкоза) в нормално или устойчиво на инсулин състояние. проведено in vitro, като се използват L6 и HepG2 клетки като модели с последните клетки, третирани с глюкозамин, за да ги направят инсулиноустойчиви.Метформин, перорално антидиабетно лекарство, беше използван като еталон, който подобрява инсулиновата чувствителност. Нашите резултати показаха, че както URAM, така и FRAM индуцират значително увеличение на усвояването на глюкоза в L6 (Фиг. S5A и S5B) или Hep клетки G2 инсулиноустойчив (Фиг. S6A и S6B) в зависимост от концентрацията, което предполага, че повишената инсулинова чувствителност може да бъде фактор, допринасящ за това, че URAM или FRAM могат да упражняват антипипогенен ефект.

URAM и FRAM потискат LPS-индуцираното производство на NO в RAW 264.7 клетки

Лечението с LPS доведе до значително увеличение на производството на NO в RAW 264,7 клетки (P

attractylodis

(А) След края на експерименталната програма животните са гладували в продължение на 12 часа с достъп до вода ad libitum. Впоследствие, 1,0 ml разтвор на лактулоза-манитол (съдържащ 66 mg/ml лактулоза и 50 mg/ml манитол) се прилага на животните през устата. След още 20 часа на гладно се събират проби от урина, за да се определи нивото на лактулоза и манитол, както е описано в раздела Материали и методи. Данните са изразени като съотношение на лактулоза към манитол. (Б) След приключване на експерименталната програма на животните се отделя кръв и се определя нивото на ендотоксините в серума, както е описано в раздела Методи. Данните са изразени като средната стойност ± SD (n = 8). Данните с различни букви са значително различни (P

След приключване на експерименталната програма на животните е направена кръв и са установени серумни провъзпалителни нива на цитокини, както е описано в раздела Методи. Данните са изразени като средната стойност ± SD (n = 8). Данните с различни букви са значително различни (P

(А) След края на експерименталната програма животните са гладували в продължение на 12 часа с достъп до вода ad libitum. След още 20 часа на гладно се събират проби от изпражнения и фекалните микробни съобщества се анализират чрез денатурираща градиентна гел електрофореза, както е описано в раздела Методи. (B) PCA на данните е извършен въз основа на матрицата от разстояние (двумерна матрица), за да се оцени допълнително сходството между бактериалните съобщества.

Изображение в пълен размер

След края на експерименталната програма животните се гладуват 12 часа с достъп до вода ad libitum. След още 20 часа на гладно се събират проби от изпражненията и се определя изобилието на 16S рРНК гена на бактериалните щамове, както е описано в раздела Методи. Резултатите се изразяват като нормализирани стойности на сгъване спрямо нормалната група. Данните са изразени като средната стойност ± SD (n = 8). Данните с различни букви се различават значително (P 38. Липсата на знания и адекватни научни доказателства за обяснение на механизма на действие ограничава популяризирането и приложението на тези лекарства. Използвайки различни експериментални модели, предишни проучвания показват ефектите Лекарствени продукти на Rhizoma Attractiveylodis Macrocephalae (RAM) срещу различни заболявания, включително затлъстяване 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 .

Полезните ефекти на пробиотиците и техните ферментирали хранителни продукти върху здравето са добре документирани 39. Доказано е, че процесът на ферментация подобрява биологичните свойства на растенията, зеленчуците и билките 18, 22, 40, 41, 42. Настоящото проучване е проведено, за да се разберат подробните молекулярни механизми, залегнали в въздействието на RAM върху затлъстяването, използвайки експериментални модели in vivo и in vitro. Освен това, друга цел на нашето проучване е да се определи дали свойството за затлъстяване на ADR е свързано с промяна в чревната микробна среда и дали ADR, ферментирал с Lactobacillus plantarum заедно с този пробиотик, може да упражни по-голям ефект срещу затлъстяването в сравнение с не- ADR. Ферментирал.

Няколко предишни проучвания предполагат, че микробните метаболитни взаимодействия гостоприемници и червата могат да играят важна роля в предразположението към затлъстяване, 43, 44, 45, което се дължи на увеличаване на капацитета за събиране на енергия от диетата и индуциране на нисък клас. Хронично системно възпаление 46, 47, 48, 49. Нашите резултати показват значително повишени нива на серумен ендотоксин, TNF-α и IL-6 при животни, хранени с диета с HFD в продължение на осем седмици, в сравнение с тези, хранени с нормална диета за същия период от време. Предишни проучвания показват, че HFD може да индуцира нискостепенно възпаление чрез повишаване на нивото на ендотоксини в резултат на модулация в чревната микробиота и повишена чревна пропускливост 12, 49. Производният от червата ендотоксин (LPS, основният компонент на външната мембрана на грам-отрицателни бактерии) стимулира възпалителни клетки, като лимфоцити и макрофаги и др., Които впоследствие произвеждат секреция на възпалителни медиатори, като NO, TNF -α, IL-6. И CRP 50, 51, 52 .

В настоящото проучване, както URAM, така и FRAM показват противовъзпалителна активност in vitro, както се демонстрира от способността им да отслабят значително LPS-индуцирана продукция на NO в RAW 267.4 клетки, без да се засяга жизнеспособността на клетките. Противовъзпалителните дейности на URAM и FRAM бяха допълнително потвърдени в нашето in vivo проучване, където и двете формулировки предизвикаха значително изчерпване на нивото на серумни ендотоксини, TNF-α и IL-6 при животни от групата на HFD + LPS. Въпреки това, в споменатите по-горе проучвания, FRAM показа значително по-високо инхибиране на производството на NO в сравнение с RAM при концентрация 50 μM, а излагането на животни от групата LPS + HFD на FRAM, но не и на URAM, доведе до значително по-ниско ниво на CRP. Критичен протеин, свързан с бактериална инфекция и възпаление 53. Въз основа на тези констатации е възможно ферментиралата RAM да е по-ефективна от неферментиралата RAM при затихване на системното възпаление.

При бозайниците е изчислено, че над 10 трилиона микроби се колонизират в стомашно-чревния тракт през живота си 65, 66. Коменсалните микроорганизми играят важна роля за насърчаване на храносмилането и усвояването на хранителни вещества, регулиране на чревната пропускливост и предотвратяване на образуването на тумори и др. чрез взаимодействие с домакина 67, 68, 69. Връзката на индуцираното от HFD затлъстяване с промени в чревната микробиота и чревно възпаление е докладвана при животински модел с диета, индуцирано затлъстяване 54. В съответствие с това, предишни проучвания са установили, че дисбалансът в чревната микробна популация допринася за развитието на затлъстяване, което се медиира чрез насърчаване на събирането на енергия от диетата, индуцирането на системно възпаление и ускоряването на отлагането на мазнини 70, 71 .

По-специално, в човешкия храносмилателен тракт почти цялата чревна микробиота (приблизително 99%) се получава от пет вида фила, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria и Proteobacteria 45. От особен интерес е намаляването както на относителното съотношение на Bacteroidetes, така и на Bacteroidetes към Firmicutes, което е значително свързано с увеличаване на телесното тегло 45, 69, 72. Освен това, няколко реда доказателства показват, че многобройни видове чревни бактерии могат да попречат на развитието и появата на затлъстяване. Например се съобщава, че благоприятен ефект срещу затлъстяването се упражнява in vivo от различни видове Lactobacillus, включително Lactobacillus plantarum 73, 74, Lactobacillus gasseri 75, Lactobacillus Casei Shirota 76 и др. Показано е, че индуцираното разпределение на мазнини 77 и Akkermansia muciniphila обръщат индуцираното от HFD затлъстяване, метаболитната ендотоксемия и подобряват глюкозната хомеостаза 48, 78 .

В заключение, ферментиралото лечение на ADR доведе до по-забележимо подобрение на затлъстяването, предизвикано от HFD, отколкото ADR. Въз основа на нашите проучвания in vitro и in vivo, възможно е антиадипогенното и анти-затлъстяването въздействие на FRAM да бъде медиирано, поне отчасти, чрез потискане на адипогенезата чрез различни механизми, засилване на усвояването на глюкозата, повлияващо разпределението. на чревната микрофлора, придружено от подобряване на чревната пропускливост и предотвратяване на ендотоксемия и свързано с нея възпаление. Необходими са бъдещи задълбочени проучвания, за да се идентифицират съединенията и медиаторите, присъстващи във ферментиралия AMR, които могат да обяснят полезните свойства на FRAM.

Методи

Бактериална култура

Инокулумът от запаса Lactobacillus plantarum беше щедър подарък от Cell Biotech (Gimpo, Южна Корея). Преди провеждане на билковата ферментация, бактериалният запас многократно се субкултивира при 37 ° С в продължение на 48 часа в бульон Lactobacilli MRS (Difco-BD, Sparks, MD, USA) при анаеробни и стерилни условия.

Приготвяне и ферментация на воден екстракт от RAM.

Животни и експериментален дизайн.

Анализи на серумни биохимични параметри

Серумът се отделя от кръвта с помощта на епруветки Vacutainer (BD, Plymouth, UK) след съсирване при стайна температура за 1 h. Серумните нива на общия холестерол (TC), липопротеините с висока плътност (HDL), триглицеридите (TG) и аспартат трансаминазата (AST) бяха определени с помощта на съответните търговски комплекти от Asan Pharmaceutical (Сеул, Южна Корея). Нивото на серумния ендотоксин се определя с помощта на комплект Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (ENDOSAFE, SC, USA), съгласно нашия предходен доклад 12 и следвайки протокола на производителя на комплекта.

Определяне на лактулоза и манитол в урината

За оценка на чревната пасивна пропускливост на животните, на които се прилага лактулоза (L) и манитол (M), нивата на тези две захари в урината се измерват с помощта на K-Lactul и K-Manol комплекти (Megazyme, Wicklow, Ireland) според нашите предишни доклад 12 и следвайки инструкциите на производителя на комплекта. Резултатите са изразени като съотношение на лактулоза към манитол (L/M).

Определяне на серумни нива на възпалителни цитокини

Нивата на С-реактивен протеин (CRP), фактор на туморна некроза-алфа (TNF-α) и интерлукин-6 (IL-6) в серума са измервани с помощта на съответните специфични за плъхове търговски комплекти ELISA (USCN, TX, USA за CRP; BioLegend, Сан Диего, Калифорния, САЩ за TNF-α и IL-6) в съответствие с инструкциите на производителя на комплекта.

Фекален микробиологичен анализ с използване на денатурираща градиентна гел електрофореза и количествена PCR в реално време (qRT-PCR)

qRT-PCR на ДНК пробите на изпражненията се извършва с помощта на LightCycler инструмент (Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA) и lightCycler FastStart DNA Master SYBR Green kit (Roche Applied Science). Праймерите (COSMO GENETCH, Сеул, Корея), използвани за насочване на 16S рРНК гена на бактериите, са показани в Таблица S2 48, 80, 81. Оптимизирането на температурите на отгряване на праймерите и стандартизирането на условията за PCR амплификационни реакции в реално време бяха проведени, както е описано по-рано 22. За анализ и интерпретация на данните е използван софтуерът LightCycler (Roche Applied Science). Относителното изобилие от бактериален тип или род беше представено от 2 −ΔC, където C t означава стойността на прага на преминаване, получена от софтуера. Крайните резултати се изразяват като нормализирани стойности на сгъване спрямо нормалната група.

Статистически анализ

Всички експериментални резултати са изразени като средната стойност ± SD (стандартно отклонение). За статистически анализ на данните е приложен статистическият пакет за социални науки (SPSS, версия 17.0, Чикаго, Илинойс, САЩ). Статистическата значимост на разликата беше определена, използвайки еднопосочен ANOVA, последван от LSD (най-малко значима разлика) post-hoc тест. Разликата се счита за статистически значима, когато P